葡萄糖磷酸異構(gòu)酶酶顯色定量測(cè)定方法的建立及性能評(píng)估*

黃亞麗，趙 珂，魏 芳，馬凱惠，李新華△

(1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，濟(jì)南 250062；2.山東省內(nèi)分泌與代謝病研究所，濟(jì)南 250012；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，濟(jì)南 250000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種病因尚未完全闡明、以侵犯四肢小關(guān)節(jié)為主的自身免疫性疾病，RA早期即可產(chǎn)生不可逆的骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞，如果未得到及時(shí)治療，RA患者在2～3年的致殘率為60%～70%，因此,RA的早期診斷及規(guī)范化治療極為重要[1-2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(GPI)可作為自身抗原,與自身免疫病尤其是RA密切相關(guān)[3]，且與活動(dòng)期患者的疼痛及腫脹關(guān)節(jié)數(shù)呈正相關(guān)[4]。有研究表明，GPI可能通過(guò)與抗體復(fù)合物激活補(bǔ)體替代途徑，誘發(fā)關(guān)節(jié)炎[5]。本文建立一種定量檢測(cè)血清GPI的酶顯色法，并對(duì)其進(jìn)行性能評(píng)估，探討此方法是否滿足臨床檢測(cè)的需求，為RA 的臨床早期篩查和診斷治療提供技術(shù)支撐。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年12月至2016年9月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院風(fēng)濕科門診和住院患者39例作為RA組，其中男13例，女26例，年齡20～83歲，平均(60±15)歲，所有患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)聯(lián)合歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟2009年修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選取同期在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院門診就診和住院的患者52例作為非RA組，其中男18例，女34例，年齡19～83歲，平均(54±17)歲，均符合國(guó)內(nèi)或國(guó)際相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中系統(tǒng)性紅斑狼瘡23例，混合型結(jié)締組織病2例，強(qiáng)直性脊柱炎6例，干燥綜合征10例，未分化結(jié)締組織病3例,多發(fā)性肌炎/皮肌炎5例，脊柱關(guān)節(jié)病2例，腸病性關(guān)節(jié)炎1例。選取在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院體檢健康者32例作為健康對(duì)照組，其中男10例，女22例，年齡26～81歲，平均(53±16)歲。排除GPI缺乏癥患者，所有受試者均空腹采集靜脈血3 mL，分離血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有?biāo)本一次凍融后測(cè)定。

1.2儀器與試劑 Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan公司，PHS-3E型pH計(jì)購(gòu)自雷磁公司，Tris購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、氯化鉀(KCl)、硫酸鎂(MgCl2)購(gòu)自西隴化工股份有限公司，D-果糖-6-磷酸二鈉、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、GPI標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自瑞士Roche公司，水溶性四氮唑鹽購(gòu)自南京旋光科技有限公司，檸檬酸、吩嗪硫酸甲酯(PMS)購(gòu)自阿拉丁公司，乙基苯基聚乙二醇(NP-40)購(gòu)自安耐吉公司；GPI ELISA試劑盒購(gòu)自上海北加生化試劑有限公司。

1.3方法

1.3.1原理及操作步驟 (1)原理：根據(jù)D-果糖-6-磷酸二鈉在GPI作用下生成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸再與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用下生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸與水溶性四氮唑鹽發(fā)生顏色反應(yīng)，在550 nm處有最大吸光度，吸光度值與GPI水平呈正比。(2)操作步驟：試驗(yàn)前10 min先將R1與R2以1∶1混勻，每孔吸取100 μL，再加10 μL標(biāo)本37 ℃反應(yīng)10 min，采用Infinite M200 Pro測(cè)定其在550 nm處的吸光度，根據(jù)GPI標(biāo)準(zhǔn)品制訂的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出標(biāo)本中GPI水平。

1.3.2試劑制備 配制稀釋液A ：其中三羥甲基氨基甲烷1 210 mg/L，EDTA-Na2372.24 mg/L，KCl 3 725 mg/L，MgCl21 016.5 mg/L，用1 mmol/L的檸檬酸調(diào)節(jié)pH至8.05。試劑R1：果糖-6-磷酸1 200 mg/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸400 mg/L，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶5 mg/L,用配制稀釋液A來(lái)溶解。試劑R2：水溶性四氮唑藍(lán)20 mg/L，PMS 2 mg/L，NP-40 1 000 mg/L。試劑制備好均置于2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3性能評(píng)價(jià) (1)精密度(CV)與偏倚：抽取2個(gè)批次的檢測(cè)試劑，分別對(duì)水平0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI質(zhì)控品進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)水平重復(fù)20次，計(jì)算批內(nèi)和批間各水平測(cè)試結(jié)果的CV，并統(tǒng)計(jì)各水平測(cè)試結(jié)果的偏倚情況。(2)干擾試驗(yàn)：分別檢測(cè)標(biāo)本添加200 mg/L膽紅素、5 g/L血紅蛋白、15 g/L三酰甘油前后的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果相對(duì)偏差在±10%以內(nèi)認(rèn)為干擾物不影響標(biāo)本測(cè)試。(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)：試劑置于2～8 ℃保存，14個(gè)月(試劑有效期12個(gè)月+延長(zhǎng)2個(gè)月)內(nèi)每個(gè)月分別測(cè)試水平為0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI質(zhì)控品，每個(gè)水平重復(fù)10次，測(cè)試結(jié)果相對(duì)偏差在±20%以內(nèi)認(rèn)為試劑穩(wěn)定性良好。(4)臨床驗(yàn)證：用本試驗(yàn)方法檢測(cè)123份臨床血清標(biāo)本，與GPI ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較，計(jì)算兩種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性和偏差。

2 結(jié) 果

2.1GPI酶顯色法定量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線 見(jiàn)圖1。分析結(jié)果顯示，線性范圍內(nèi)各水平與測(cè)試值呈平滑遞增曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.042 9X+0.108 3，r2=0.992 3。

圖1 GPI酶顯色法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2GPI酶顯色定量測(cè)定方法的精密度與偏倚分析 見(jiàn)表1。采用2批次配液同時(shí)測(cè)定，每個(gè)質(zhì)控重復(fù)測(cè)定20次，批內(nèi)與批間各檢測(cè)水平CV<10%，且t檢驗(yàn)顯示各水平測(cè)試結(jié)果偏倚可接受(P>0.05)。

表1 兩批試劑精密度與偏倚分析結(jié)果比較

2.3各干擾物加入前后測(cè)定結(jié)果比較 見(jiàn)表2。臨床上對(duì)于血清測(cè)定的干擾因素主要有脂濁、黃疸和溶血。試驗(yàn)采用添加干擾物的方式進(jìn)行，分別在高、中、低值血清中添加不同水平的干擾物質(zhì)，該試劑在膽紅素水平≤200 mg/L、血紅蛋白水平≤5 g/L、三酰甘油水平≤15 g/L的情況下，各水平范圍的平均偏差均在5%內(nèi)，根據(jù)臨床標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)要求偏差應(yīng)在±10%以內(nèi)，完全在臨床上使用的可接受范圍內(nèi)。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果比較 見(jiàn)表3。14個(gè)月內(nèi)檢測(cè)水平為0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI質(zhì)控品，各水平相對(duì)偏差在±20%以內(nèi)，試劑有效期>12個(gè)月。

2.5回收率測(cè)定 分析樣品1(GPI水平0.30 mg/L)和樣品2(GPI水平0.60 mg/L)重復(fù)測(cè)定5次，平均回收水平分別為0.31 mg/L和0.59 mg/L，回收率分別為103.3%和98.3%，平均回收率為100.8%。

表2 各干擾物加入前、后測(cè)定結(jié)果比較

表3 GPI的酶顯色法定量測(cè)定穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果比較

注：0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI質(zhì)控品±20%分別為0.04～0.06、0.24～0.36、0.48～0.72 mg/L

2.6兩種方法檢測(cè)3組臨床標(biāo)本結(jié)果比較 見(jiàn)表4。分別采用酶顯色法和ELISA試劑盒檢測(cè)123份血清標(biāo)本，均得到123份有效數(shù)據(jù)。兩種方法在RA組(n=39)、非RA組(n=52)和健康對(duì)照組(n=32)間臨床標(biāo)本檢測(cè)數(shù)據(jù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.38，P>0.05)。

表4 GPI酶顯色法與ELISA試劑盒檢測(cè)3組臨床標(biāo)本GPI結(jié)果比較

3 討 論

RA是一種免疫功能紊亂引起的自身免疫性疾病，患者體內(nèi)存在多種自身抗原和自身抗體，其具體病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確，探討其發(fā)病機(jī)制對(duì)于RA的診治和預(yù)防至關(guān)重要。GPI是一種廣泛表達(dá)并且具有多種功能的蛋白質(zhì)，它是能量循環(huán)和糖分解過(guò)程中必不可少的胞漿酶，同時(shí)它又是細(xì)胞外信號(hào)的傳導(dǎo)分子[6]。GPI分泌運(yùn)動(dòng)因子和神經(jīng)細(xì)胞因子，可能在腫瘤和自身免疫方面起一定作用[7-8]。GPI可誘導(dǎo)C57BL/10小鼠產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎，疾病的發(fā)生與Ⅱ型主要組織相容性復(fù)合體相關(guān)[9]。GPI水平在RA活動(dòng)組和非活動(dòng)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與RA患者的關(guān)節(jié)腫脹、疼痛呈正相關(guān)。GPI對(duì)于RA疾病的早期診斷，了解病情的發(fā)生和發(fā)展、治療及判斷預(yù)后均有重要價(jià)值[8]。關(guān)于GPI及其抗體在RA中的診斷價(jià)值，大多數(shù)研究結(jié)果表明,GPI抗原診斷RA的敏感度>65%，特異度≥90%，有較高的診斷價(jià)值[9-10];而抗GPI抗體在RA診斷中的研究結(jié)果差異較大，特異度為64.3%～95.9%[11-12]。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室可選擇合適的標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)來(lái)提高特異度和敏感度，更好地對(duì)RA 進(jìn)行診斷及療效觀察。所以迫切需要一種能快速準(zhǔn)確且敏感度和精密度高的檢測(cè)GPI的方法來(lái)滿足RA的臨床診斷。

本研究建立了一種新的快速檢測(cè)血清GPI的方法，檢測(cè)線性范圍為0.000 82～2.500 00 mg/L，在線性范圍內(nèi)有較好的精密度和準(zhǔn)確度。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，12個(gè)月內(nèi)檢測(cè)水平為0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI質(zhì)控品，各水平相對(duì)偏差可控制在允許范圍內(nèi)，認(rèn)為試劑有效期>12個(gè)月。干擾物膽紅素(200 mg/L)、血紅蛋白(5 g/L)、三酰甘油(15 g/L)不影響試劑檢測(cè)。GPI酶顯色法檢測(cè)結(jié)果與ELISA試劑盒的測(cè)定結(jié)果有良好的相關(guān)性，且兩種方法測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

隨著GPI檢測(cè)項(xiàng)目在臨床應(yīng)用的快速開展，對(duì)于檢測(cè)技術(shù)的快速準(zhǔn)確和高效提出了新的要求。本研究建立的GPI酶顯色法定量檢測(cè)試劑敏感度、精密度和特異度較高，可重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，與GPI ELISA試劑盒的測(cè)定結(jié)果比較有較好的一致性。與現(xiàn)有同類產(chǎn)品相比，本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于：(1)可采用酶顯色法對(duì)GPI進(jìn)行定量檢測(cè)；(2)操作簡(jiǎn)單快速，相比現(xiàn)有定量檢測(cè)產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)間短；(3)無(wú)需配備大型儀器設(shè)備，使用成本相對(duì)低廉，適合于地方基層醫(yī)院應(yīng)用。本研究不足之處是標(biāo)本量較少，仍需要收集更多的病例來(lái)驗(yàn)證該試驗(yàn)結(jié)果，還應(yīng)同時(shí)開展深入大量的臨床研究來(lái)確定不同地區(qū)、不同人種、不同實(shí)驗(yàn)室建立相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。