術(shù)前中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值對(duì)乳腺腫瘤的預(yù)測(cè)價(jià)值及其與Beclin1的關(guān)系*

宦 宇,蔡徐山△,焦家軍,張春利

(上海市嘉定區(qū)婦幼保健院:1.檢驗(yàn)科;2.乳腺科 201821)

炎性反應(yīng)與多種腫瘤相關(guān)，腫瘤的微環(huán)境在腫瘤進(jìn)展中起重要作用，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移。中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比值(NLR)已成為全身炎性反應(yīng)簡(jiǎn)單且有效的指標(biāo)。有研究證明，NLR 增高在乳腺癌中可作為預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]，且對(duì)乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有預(yù)測(cè)價(jià)值[2]。Beclin1是形成自噬體的必須分子，可介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位于吞噬泡，并與多種蛋白反應(yīng)調(diào)控自噬體形成與成熟。而自噬功能缺乏可刺激炎癥小體形成,適度自噬可抑制炎性反應(yīng)[3]。本研究探討外周血NLR 與乳腺癌臨床病理特征之間、自噬相關(guān)基因在乳腺癌中的表達(dá)情況，以及二者之間的關(guān)系。從而評(píng)估NLR對(duì)乳腺腫瘤的預(yù)測(cè)價(jià)值，同時(shí)試圖對(duì)炎性反應(yīng)、自噬、腫瘤三者之間的關(guān)系做簡(jiǎn)單解釋。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2017年8月在本院接受手術(shù)治療，且經(jīng)病理科證實(shí)為原發(fā)性浸潤(rùn)性乳腺癌的患者共126例作為乳腺癌組，均為女性，年齡33～69歲，中位年齡56歲，所有病例手術(shù)前均未做過(guò)任何化療、放療及生物治療。另選取同期病理檢查均為纖維腺瘤的良性乳腺腫瘤患者102例作為乳腺良性腫瘤組，乳腺良性腫瘤組病例也均為女性，年齡31～67 歲，中位年齡52歲。乳腺癌腫瘤組織為術(shù)中取得，同時(shí)選取距離病灶位置至少3 cm處的癌旁組織進(jìn)行比較，所有組織標(biāo)本均置于RNALater保存液中-80 ℃冰箱保存。所有患者的臨床資料，如腫瘤塊大小、腫瘤級(jí)別、淋巴結(jié)入侵情況、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)的表達(dá)等均來(lái)自本院病理科。排除標(biāo)準(zhǔn)：70歲以上患者;術(shù)前感冒或其他可影響血常規(guī)計(jì)數(shù)結(jié)果的疾病患者。

1.2儀器與試劑 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀MEK-8222k極其配套試劑(日本光電公司)，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(ABI 7300)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(TAKARA公司)，RNAlater(QIAGEN公司 )，Tizol試劑。

1.3方法

1.3.1血標(biāo)本采集與處理 患者于術(shù)前2 d內(nèi)采集晨起空腹外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝。采血當(dāng)天無(wú)發(fā)熱等臨床感染征象。檢測(cè)白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，外周血NLR 由中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)/淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)獲得，檢測(cè)在2 h內(nèi)完成。

1.3.2RT-PCR分析 按Tizol試劑說(shuō)明書(shū)步驟提取組織總RNA。Beclin1、GAPDH引物均由上海英淮捷基公司合成。Beclin1上游引物序列為5′-GGC TGA GAG ACT GGA TCA GG-3′，下游引物序列為5′-CTG CGT CTG GGC ATA ACG-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度為364 bp。GAPDH上游引物序列為5′-ACT TTG GTA TCG TGG AAG GAC TCA T-3′,下游引物序列為5′-GTT TTT CTA GAC GGC AGG TCA GG-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度為255 bp。反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃ 1 min。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，70 ℃ 50 s，循環(huán)40次；70 ℃ 5 min。

2 結(jié) 果

2.1外周血NLR與乳腺良、惡性腫瘤的關(guān)系 乳腺良性腫瘤組NLR為1.22±0.29，乳腺癌組為2.10±0.78，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.72，P<0.05)。

2.2乳腺癌組術(shù)前外周血NLR與臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。不同年齡分組中NLR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者NLR明顯低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ki67表達(dá)率大于或等于20%的患者NLR明顯高于表達(dá)率低于20%的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而腫瘤直徑、病理分級(jí)、ER、PR、HER-2等臨床病理特征分組中NLR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 乳腺癌組術(shù)前外周血NLR與臨床病理特征的關(guān)系

2.3乳腺癌組織和癌旁組織中Beclin1 mRNA的表達(dá) 隨機(jī)挑選20例乳腺癌組織和與其對(duì)應(yīng)的癌旁組織，采用RT-PCR檢測(cè)組織中Beclin1 mRNA表達(dá)水平。圖1所示，乳腺癌組織中Beclin1 mRNA表達(dá)水平平均為1.35±0.96，而癌旁組織平均為 3.17±1.59,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在80%(16/20)的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，Beclin1在乳腺癌組織標(biāo)本中表達(dá)下調(diào)，另有20%(4/20)的標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)Beclin1在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)。

圖1 乳腺癌和癌旁組織標(biāo)本中Beclin1mRNA表達(dá)水平

2.4Beclin1 mRNA的表達(dá)和外周血NLR的關(guān)系 根據(jù)腫瘤組織和癌旁組織Beclin1 mRNA表達(dá)水平差異情況,將上述20例患者標(biāo)本分為Beclin1 mRNA表達(dá)下調(diào)組和未下調(diào)組，結(jié)果顯示，Beclin1 mRNA下調(diào)組外周血NLR為3.15±1.54,未下調(diào)組為1.07±0.19,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.714,P<0.05)。

3 討 論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年其發(fā)病率已位居我國(guó)女性惡性腫瘤的首位，且逐年遞增[4-6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，NLR與多種實(shí)體腫瘤的預(yù)后相關(guān)，可能原因是升高的NLR與炎性反應(yīng)相關(guān)[7-10]。NLR 在臨床中有獲取簡(jiǎn)便，不額外增加檢測(cè)費(fèi)用，臨床可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞自噬是不同于凋亡且不依賴(lài)于caspase的一種程序性細(xì)胞死亡，它作為程序性細(xì)胞死亡的另一種形式，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。第一個(gè)哺乳動(dòng)物自噬基因是Beclin1，它是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，廣泛存在于人類(lèi)正常組織中。

本研究發(fā)現(xiàn),術(shù)前外周血乳腺癌組較乳腺良性腫瘤組NLR明顯升高，提示NLR有助于判斷乳腺良、惡性病變。NLR所受干擾因素較多，如感冒、高血壓、腎臟疾病、糖尿病、高膽固醇等，甚至吸煙、飲食、飲酒等生活習(xí)慣也會(huì)干擾其檢測(cè)結(jié)果，所以目前NLR用于乳腺腫瘤良、惡性判斷的臨界值尚很難確定，臨床工作中仍然最終需要病理活檢作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但本研究結(jié)果提示,NLR可作為判斷乳腺腫瘤良、惡性病變的一項(xiàng)參考指標(biāo)。

詹妍等[1]研究發(fā)現(xiàn),NLR與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM分期及ER、PR、HER2相關(guān),與年齡等因素?zé)o關(guān)；胡赟宏等[2]研究發(fā)現(xiàn),NLR僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目相關(guān)，與其他臨床病理因素均無(wú)關(guān)。本研究結(jié)果顯示,NLR在年齡大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki67表達(dá)率高低患者間有明顯差異。但未發(fā)現(xiàn)與其他乳腺癌相關(guān)臨床特征相關(guān)，這可能是因?yàn)镹LR受病理生理因素影響較大，不同的研究者統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果存在差異，所以還需更大標(biāo)本量的研究予以證實(shí)。另有研究發(fā)現(xiàn)，NLR可能與乳腺癌不同的分子分型相關(guān)[11]，這一結(jié)果為進(jìn)一步研究提供了思路和方向。

有學(xué)者采用免疫組織化學(xué)法分析乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌及其與之對(duì)應(yīng)的正常乳腺組織。Beclin1免疫活性在正常乳腺上皮細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá),而乳腺癌組織中的表達(dá)水平卻明顯下降。本研究采用RT-PCR檢測(cè)Beclin1 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，Beclin1 mRNA在乳腺癌組織的表達(dá)低于癌旁組織，與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道一致。

有研究發(fā)現(xiàn),炎性反應(yīng)介質(zhì)中的活性氧細(xì)胞因子及炎性反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控自噬反應(yīng)，而自噬反應(yīng)又可通過(guò)TLR、NLR 等信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，并且自噬反應(yīng)是誘發(fā)炎性反應(yīng)性疾病的重要因素[14]。對(duì)于信號(hào)、轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)節(jié)自噬體形成和成熟過(guò)程的相關(guān)信號(hào)通路的分子機(jī)制和功能研究表明,Ⅰ型磷酸肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和腺苷酸活化蛋白激酶信號(hào)通路都可調(diào)節(jié)自噬反應(yīng)的過(guò)程，換句話(huà)說(shuō)自噬反應(yīng)與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[15]。本研究為了初步探討炎性反應(yīng)、自噬、腫瘤三者之間的關(guān)系，根據(jù)Beclin1 mRNA的表達(dá)下調(diào)情況將腫瘤患者進(jìn)行分組分析發(fā)現(xiàn)，Beclin1 mRNA表達(dá)下調(diào)組外周血NLR與未下調(diào)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但由于本研究標(biāo)本量有限，且缺少相關(guān)機(jī)制研究，炎性反應(yīng)、自噬反應(yīng)、腫瘤三者之間的關(guān)系是否確實(shí)如本研究結(jié)果所示，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。