轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1對(duì)腫瘤血管形成的影響*

馬 銳，萬(wàn)巧鳳，于 佳

(寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004)

正常機(jī)體在生理狀態(tài)下血管新生是暫時(shí)的，并且機(jī)體嚴(yán)密監(jiān)視、控制這一過(guò)程。但在病理?xiàng)l件下，血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管生長(zhǎng)的能力將使增生組織或細(xì)胞異常增殖。同時(shí)，血管形成受多種信號(hào)調(diào)控，這些信號(hào)能夠調(diào)控血管生成的狀態(tài)，包括基因突變、免疫細(xì)胞在局部浸潤(rùn)、代謝應(yīng)激(如缺氧、酸中毒、堿中毒、低血糖)、增殖壓力改變等。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)有許多生物學(xué)作用，如參與胚胎發(fā)育、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化，甚至誘導(dǎo)程序性死亡；另外，TGF-β還參與細(xì)胞外基質(zhì)形成、抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生，促進(jìn)黏附分子表達(dá)，進(jìn)而抑制免疫應(yīng)答，修復(fù)受損組織等。TGF-β家族中研究最多的是TGF-β1，它是一種多功能生長(zhǎng)因子，分布于多種組織細(xì)胞內(nèi)，激活其下游的胞內(nèi)信號(hào)蛋白，介導(dǎo)TGF-β1的信號(hào)傳遞，進(jìn)而發(fā)揮重要生物學(xué)效應(yīng)。有研究顯示，在成纖維促血管生成中，TGF-β1信號(hào)通路可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表型發(fā)生改變，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白α(α-SMA)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)A表達(dá),使成纖維細(xì)胞形成小管樣結(jié)構(gòu)[1]。有研究表明，TGF-β基因敲除的小鼠表現(xiàn)有血管發(fā)育缺陷，致胚胎死亡[2]。目前TGF-β對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用及轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究還比較少，GATA6能夠與TGF-β基因的啟動(dòng)子結(jié)合，參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。而GATA6分子在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的生存和調(diào)節(jié)周圍血管[3]，這些理論知識(shí)為利用TGF-β1刺激大鼠內(nèi)皮細(xì)胞提供了有利條件。

1 材料與方法

1.1材料 SD健康雄性大鼠，6～8周，體質(zhì)量160～200 g，購(gòu)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(上海美軒生物科技有限公司)，TGF-β1(Invitrogen公司)，Matrigel膠(BD公司)，ECM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州蘇潔醫(yī)療)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(博科公司)，生物安全柜(Thermo公司)，普通倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠主動(dòng)脈環(huán)形成試驗(yàn) SD大鼠戊巴比妥鈉腹腔麻醉后打開(kāi)腹腔，迅速分離出大鼠的胸主動(dòng)脈，若有出血，用紗布拭去，保持視野清晰(過(guò)程中注意無(wú)菌操作)；Matrigel膠提前從-20 ℃移至4 ℃冰箱過(guò)夜，將Matrigel膠加入48孔板中，并在37 ℃培養(yǎng)箱中放置30 min，使其凝固。小心將大鼠的胸主動(dòng)脈結(jié)締組織和脂肪剔除掉，注意不能剪破血管；放入盛有100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的冰磷酸鹽緩沖液(PBS)中，再將動(dòng)脈剪成小段，每段長(zhǎng)度1～2 mm；用PBS清洗主動(dòng)脈環(huán)，取出37 ℃培養(yǎng)箱中的48孔板，將動(dòng)脈環(huán)小心接種到48孔板的Matrigel膠上；再將液態(tài)Matrigel膠覆蓋于環(huán)上，形成夾心狀；37 ℃培養(yǎng)箱中放置30 min，使其凝固；凝固后，在每孔Matrigel膠上層給予3.125、6.250、12.500 ng/mL TGF-β1(ECM培養(yǎng)基配制)的MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，比較各種TGF-β1水平對(duì)大鼠主動(dòng)脈環(huán)形成的影響。同一水平設(shè)3個(gè)復(fù)孔置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q1次，每日拍照。

1.2.2新生血管分支長(zhǎng)度比較 倒置顯微鏡觀察大鼠主動(dòng)脈形成的血管分支，對(duì)不同組別進(jìn)行測(cè)量并統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠主動(dòng)脈環(huán)血管形成試驗(yàn) 見(jiàn)圖1。

注：A為3.125 ng/mL TGF-β1組；B為6.250 ng/mL TGF-β1組；C為12.500 ng/mL TGF-β1組

圖1各種TGF-β1水平對(duì)大鼠主動(dòng)脈環(huán)形成的影響(×120)

2.2不同水平TGF-β1刺激試驗(yàn)大鼠新生血管分支長(zhǎng)度比較 誘導(dǎo)48 h后，3.125、6.250、12.500 ng/mL TGF-β1刺激試驗(yàn)大鼠主動(dòng)脈環(huán)外周血管分支長(zhǎng)度分別為(0.600±0.041)、(0.900±0.309)、(1.200±0.238)mm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明MDA-MB-231人類乳腺癌細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，血管分支長(zhǎng)度增加。

3 討 論

目前，乳腺癌仍是導(dǎo)致女性死亡的重要疾病,雖然現(xiàn)代診斷和治療技術(shù)不斷提高，乳腺腫瘤患者病死率逐年下降，但其病死率仍高達(dá)35%。因此，篩選出具有早期診斷價(jià)值的靶標(biāo)分子，對(duì)于改善預(yù)后意義重大。TGF-β1及其下游信號(hào)通路研究目前已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)[3-4]。作為DPC4基因的傳遞蛋白，TGF-β1已被證明DPC4突變或缺失與多種腫瘤相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞分泌的眾多因子中，何種因子介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞從原有血管出芽形成新的腫瘤血管，并發(fā)揮的關(guān)鍵作用還不十分清楚。血管生成后，血管大量增殖，形成類似毛細(xì)血管網(wǎng)的細(xì)胞環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這是腫瘤新血管生長(zhǎng)的重要步驟。

目前已有許多藥物針對(duì)血管生成靶向性方向治療乳腺腫瘤，如索拉非尼[5]。在健康人體內(nèi)，血管生成是被嚴(yán)格控制的，但在腫瘤組織中，血管生成迅速，一方面供給腫瘤組織營(yíng)養(yǎng)，另一方面實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。因此，如何行之有效地切斷腫瘤組織血管生成途徑，已被研究人員公認(rèn)為是治療腫瘤的有效途徑。尤其是某些促血管生成因子，可以在原有管腔內(nèi)大量釋放，這些因子似“誘餌”激活血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的相應(yīng)受體，如VEGF-VEGFR結(jié)合、活化內(nèi)皮細(xì)胞、釋放水解酶及蛋白酶，發(fā)揮纖維溶解作用，溶解血管基底膜[6-7]。探明以上機(jī)制，對(duì)于腫瘤細(xì)胞如何最終形成管腔，以致成熟血管形成，具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

本研究旨在研究TGF-β1對(duì)于乳腺腫瘤細(xì)胞血管生成的影響；為腫瘤細(xì)胞侵襲、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等提供理論佐證，進(jìn)而對(duì)TGF-β1及其受體、信號(hào)通路研究提供了前期基礎(chǔ)[8-9]。在前期多次預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究分離出大鼠胸主動(dòng)脈，并制作體外主動(dòng)脈環(huán)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，借助Matrigel膠模擬的細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)環(huán)境，進(jìn)行血管形成試驗(yàn)觀察。48 h后經(jīng)倒置顯微鏡比較發(fā)現(xiàn)，人類乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，血管出芽數(shù)量、密度增加，而且血管分支長(zhǎng)度也增長(zhǎng)。TGF-β1使MDA-MB-231人類乳腺癌細(xì)胞遷移和血管生成的能力增強(qiáng)，在后續(xù)研究中，作者將對(duì)其調(diào)控的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探究。