外源性膽紅素對(duì)缺血缺氧性腦損傷大鼠認(rèn)知功能及海馬組織中蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3/B細(xì)胞淋巴瘤基因-2通路的影響

侯立維，孔麗娜，杜開(kāi)先

(1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450014；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院小兒神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

缺血缺氧性腦損傷是圍生期常見(jiàn)的疾病[1-2]，是造成新生兒死亡及神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因之一，其致死率和致殘率高，嚴(yán)重威脅新生兒的生命[3-4]。地塞米松是治療缺血缺氧性腦損傷的常用藥物，但長(zhǎng)期使用會(huì)引發(fā)肌無(wú)力、肌萎縮，甚至影響幼兒骨骼生長(zhǎng)和發(fā)育[5]。膽紅素是一種抗氧化劑，對(duì)癌癥、心腦血管疾病及神經(jīng)性疾病具有防治作用[6-7]。然而，外源性膽紅素對(duì)缺血缺氧性腦損傷大鼠認(rèn)知功能的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以地塞米松為陽(yáng)性對(duì)照藥物，探討外源性膽紅素對(duì)缺血缺氧性腦損傷大鼠認(rèn)知功能及海馬組織中蛋白酪氨酸激酶2 (janus activated kinase-2，JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3(signaltransducer and activator of transcription-3，STAT3)/B細(xì)胞淋巴瘤基因-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)/信號(hào)通路的影響，旨在為缺血缺氧性腦損傷的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)特定病原體級(jí)7日齡雄性Wistar大鼠72只，體質(zhì)量11.5～16.4 g，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK(京)2015-0045。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、地塞米松組、外源性膽紅素低劑量組、外源性膽紅素中劑量組、外源性膽紅素高劑量組，每組12只，在室內(nèi)溫度18～25 ℃、相對(duì)濕度為40%～50%的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水，食物為全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，2 d更換墊料1次。

1.2主要試劑與儀器膽紅素、地塞米松購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所，辣根過(guò)氧化物酶購(gòu)自上海倍卓生物科技有限公司，兔抗鼠p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的 dUTP 缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒購(gòu)自杭州碧云天生物技術(shù)有限公司，二氨基聯(lián)苯胺 (diaminobenzidine，DAB) 顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；3K15超低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；SW-CJ-2D2G2F2FD雙人凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，精密電子天平購(gòu)自美國(guó)Adventurer公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海第三分析儀器廠。

1.3動(dòng)物模型制備采用經(jīng)典Rice法制備缺血缺氧性腦損傷大鼠模型[8]：將各組大鼠腹腔注射40 g·L-1水合氯醛進(jìn)行麻醉，剪毛消毒后，將其固定于腦立體定位儀上，沿頸中線切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，用5/0絲線結(jié)扎頸外動(dòng)脈(假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎)，縫合組織及皮膚，待大鼠蘇醒后回籠飼養(yǎng)。模型制備4 h后，地塞米松組大鼠腹腔內(nèi)注射 10 mg·kg-1地塞米松[9]；外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠分別腹腔內(nèi)注射5、10、15 mg·kg-1外源性膽紅素[10]，假手術(shù)組、模型組大鼠腹腔內(nèi)注射等量的生理鹽水，連續(xù)給藥2周。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠認(rèn)知功能治療2周后，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠空間位置學(xué)習(xí)記憶能力[11]，實(shí)驗(yàn)期間保持平臺(tái)位置不變，環(huán)境安靜，四周光照程度一樣，水池壁上黃色膠布標(biāo)記，室溫和水溫均控制在22～26 ℃。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：將大鼠置于圓形不銹鋼水池，任意選2個(gè)與平臺(tái)等距的入水點(diǎn)，將動(dòng)物面朝池壁輕輕放入水中，記錄大鼠90 s內(nèi)尋找平臺(tái)時(shí)間(逃避潛伏時(shí)間)，實(shí)驗(yàn)第1、2、3、4天每天訓(xùn)練2次，2次訓(xùn)練潛伏時(shí)間的平均值記為當(dāng)天逃避潛伏時(shí)間。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：第5天撤走安全平臺(tái)，隨機(jī)選取入水點(diǎn)，將大鼠放入水中，記錄大鼠90 s內(nèi)找到目標(biāo)象限穿越平臺(tái)次數(shù)及探索平臺(tái)的速度，實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行1次，并以此數(shù)據(jù)作為空間學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè)指標(biāo)。

1.5TUNEL法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡情況水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取5只大鼠，采用10 g·L-1水合氯醛(4 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，于無(wú)菌條件下打開(kāi)胸腔，暴露心臟，使用40 g·L-1多聚甲醛灌注固定，直至心臟變白、四肢僵硬，迅速斷頭取腦，一部分腦組織保存于-80 ℃冰箱中，另一部分腦組織置于體積分?jǐn)?shù)10%的中性甲醛溶液中固定4 h。參照文獻(xiàn)中大鼠腦立體定位圖譜取其海馬組織[12]，制作石蠟切片，脫蠟、脫水后添加DNA 斷裂的TUNEL反應(yīng)液，37 ℃避光孵育 1 h，清洗后添加 50 μL辣根過(guò)氧化物酶，37 ℃避光孵育30 min，清洗后添加DAB顯色液，室溫孵育 5 min，期間觀察組織切片染色情況，用單蒸水終止顯色。經(jīng)梯度乙醇水合、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組切片顯色情況。正常神經(jīng)元經(jīng)蘇木精復(fù)染后細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞體縮小，核固縮，染色質(zhì)凝聚，呈棕黃色或黃褐色顆粒，表現(xiàn)出凋亡的特征。采用Image ProPlus 5.1軟件分析每張照片，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)，每張切片取5個(gè)不同視野進(jìn)行觀察，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.6Westernblot法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)取腦組織，研磨后加入裂解液提取海馬組織總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣體積 20 μL，電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜50 min，分別滴加一抗兔抗鼠p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2多克隆抗體，4 ℃過(guò)夜，滴加二抗，37 ℃ 放置1 h。顯影后采集圖像，以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用Gel-Pro analyzer 4軟件定量分析p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.16組大鼠逃避潛伏時(shí)間比較結(jié)果見(jiàn)表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠第1、2、3、4天逃避潛伏時(shí)間均顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，地塞米松組和外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠第1、2、3、4天逃避潛伏時(shí)間均顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與地塞米松組比較，外源性膽紅素低、中劑量組大鼠第1、2、3、4天逃避潛伏時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)。外源性膽紅素高劑量組大鼠第1、2、3、4天逃避潛伏時(shí)間與地塞米松組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著外源性膽紅素劑量增加，外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠第1、2、3、4天逃避潛伏時(shí)間呈縮短趨勢(shì)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表16組大鼠逃避潛伏時(shí)間比較

組別n逃避潛伏時(shí)間/s第1天第2天第3天第4天假手術(shù)組1245.16±4.3634.18±4.1321.32±3.4313.58±3.02模型組12121.43±8.56a108.13±8.35a101.75±8.06a85.26±7.73a地塞米松組1257.71±5.73b48.52±6.12b40.16±4.02b25.43±3.56b外源性膽紅素低劑量組1299.54±8.15bc86.72±7.82bc80.71±7.63bc63.21±5.45bc外源性膽紅素中劑量組1277.43±7.41bcd66.03±5.61bcd59.36±5.24bcd42.53±4.03bcd外源性膽紅素高劑量組1258.78±6.52bde47.21±4.32bde38.87±3.91bde24.46±3.75bde

注：與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與地塞米松組比較cP<0.05；與外源性膽紅素低劑量組比較dP<0.05；與外源性膽紅素中劑量組比較eP<0.05。

2.26組大鼠探索平臺(tái)情況比較結(jié)果見(jiàn)表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及探索平臺(tái)速度均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，地塞米松組和外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及探索平臺(tái)速度顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與地塞米松組比較，外源性膽紅素低、中劑量組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及探索平臺(tái)速度均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。外源性膽紅素高劑量組與地塞米松組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及探索平臺(tái)速度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著外源性膽紅素劑量增加，外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及探索平臺(tái)速度呈增加趨勢(shì)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.36組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡情況比較假手術(shù)組、模型組、地塞米松組及外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡率分別為(7.32±1.78)%、(58.42±2.78)%、(15.13±1.93)%、(42.36±2.54)%、(27.53±2.23)%、(15.42±1.97)%。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡率顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，地塞米松組和外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡率均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與地塞米松組比較，外源性膽紅素低、中劑量組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡率均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組與地塞米松組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著外源性膽紅素劑量增加，外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡率呈降低趨勢(shì)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

表26組大鼠探索平臺(tái)情況比較

組別n穿越平臺(tái)次數(shù) 探索平臺(tái)速度/(cm·s-1)假手術(shù)組128.94±1.13 28.76±1.41 模型組123.02±0.63a23.42±0.61a地塞米松組127.56±1.06b27.36±1.03b外源性膽紅素低劑量組124.52±0.78bc24.07±0.76bc外源性膽紅素中劑量組126.11±0.86bcd25.13±0.83bcd外源性膽紅素高劑量組127.53±1.03bde27.24±0.97bde

注：與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與地塞米松組比較cP<0.05；與外源性膽紅素低劑量組比較dP<0.05；與外源性膽紅素中劑量組比較eP<0.05。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：地塞米松組；D：外源性膽紅素低劑量組；E：外源性膽紅素中劑量組；F：外源性膽紅素高劑量組。

圖16組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡情況(TUNEL法，×400)

Fig.1Apoptosisinhippocampusofratsinthesixgroups(TUNEL，×400)

2.46組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較結(jié)果見(jiàn)表3和圖2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，地塞米松組和外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與地塞米松組比較，外源性膽紅素低、中劑量組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。外源性膽紅素高劑量組與地塞米松組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著外源性膽紅素劑量增加，外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表達(dá)水平呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表36組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

組別np-JAK2 p-STAT3 Bcl-2 假手術(shù)組50.28±0.03 0.42±0.04 0.21±0.01 模型組50.92±0.08a1.15±0.12a0.98±0.10a地塞米松組50.32±0.03b0.52±0.05b0.40±0.03b外源性膽紅素低劑量組50.73±0.07bc0.94±0.09bc0.79±0.08bc外源性膽紅素中劑量組50.54±0.06bcd0.73±0.07bcd0.59±0.06bcd外源性膽紅素高劑量組50.34±0.04bde0.51±0.05bde0.38±0.06bde

注：與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與地塞米松組比較cP<0.05；與外源性膽紅素低劑量組比較dP<0.05；與外源性膽紅素中劑量組比較eP<0.05。

1：假手術(shù)組；2：模型組；3：地塞米松組；4：外源性膽紅素低劑量組；5：外源性膽紅素中劑量組；6：外源性膽紅素高劑量組。

圖26組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3和Bcl-2蛋白的表達(dá)(Westernblot)

Fig.2Expressionofp-JAK2，p-STAT3andBcl-2proteininhippocampusofratsinthesixgroups(Westernblot)

3 討論

缺血缺氧性腦損傷是臨床常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，常引發(fā)腦水腫、腦組織壞死以及神經(jīng)損傷，導(dǎo)致患者認(rèn)知功能障礙，如記憶力減退、運(yùn)動(dòng)功能及學(xué)習(xí)能力減退等[13-14]，甚至危及患者生命。因此，探尋安全、高效的藥物治療缺血缺氧性腦損傷具有重要意義。

膽紅素是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的代謝終產(chǎn)物，研究顯示，膽紅素具有抗菌消炎、抗癌、抗氧化、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡等多種藥理功能[15]。MIRELES等[16]研究表明，外源性膽紅素可避免紅細(xì)胞氧化反應(yīng)時(shí)結(jié)構(gòu)損傷。萬(wàn)英等[10]研究表明，外源性膽紅素能夠減輕急性腎缺血再灌注損傷，發(fā)揮對(duì)腎組織的保護(hù)作用。侯立維等[17]研究表明，外源性膽紅素能夠減輕缺血缺氧性腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)缺血缺氧性腦損傷神經(jīng)起保護(hù)作用。ADIN等[18]研究表明，外源性膽紅素在胰島分離和低氧應(yīng)激小鼠中表現(xiàn)出細(xì)胞保護(hù)和抗氧化作用。然而，膽紅素對(duì)缺血缺氧性腦損傷大鼠認(rèn)知功能及海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，地塞米松組和外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠逃避潛伏時(shí)間顯著縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)、探索平臺(tái)速度顯著提高，海馬組織中細(xì)胞凋亡率顯著降低；與地塞米松組比較，外源性膽紅素低、中劑量組大鼠逃避潛伏時(shí)間顯著延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)及探索平臺(tái)速度均顯著降低，海馬組織中細(xì)胞凋亡率顯著升高，而外源性膽紅素高劑量組大鼠與地塞米松組比較逃避潛伏時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)、探索平臺(tái)的速度以及海馬組織中細(xì)胞凋亡率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且隨著外源性膽紅素劑量增加，外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠各時(shí)間點(diǎn)大鼠逃避潛伏時(shí)間呈縮短趨勢(shì)，穿越平臺(tái)次數(shù)及探索平臺(tái)速度呈增加趨勢(shì)，海馬組織中細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示，外源性膽紅素能夠改善缺血缺氧性腦損傷大鼠的認(rèn)知功能，并抑制海馬組織中細(xì)胞凋亡，且具有一定的劑量依賴性。

外源性膽紅素能夠抑制海馬細(xì)胞凋亡，但具體的作用機(jī)制尚未完全明確。JAK2、STAT3、Bcl-2是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白，JAK2/STAT3/Bcl-2通路在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。有研究顯示，膽紅素可下調(diào)凋亡蛋白表達(dá)水平，增強(qiáng)Bcl-2活性，增大Bcl-2/Bax比值，在缺血再灌注過(guò)程中抑制神經(jīng)元凋亡[19]。鄧士兵等[20]研究表明，通過(guò)調(diào)控JAK2/STAT3/Bcl-2信號(hào)通路的活性，能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡。鮑天昊等[21]研究表明，上游的JAK2蛋白分子與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，能夠誘導(dǎo)受體和JAK2磷酸化，活化的JAK2分子能夠誘導(dǎo)下游的STAT3發(fā)生磷酸化，STAT3被活化后進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄的發(fā)生，進(jìn)而調(diào)控抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，地塞米松組和外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低；與地塞米松組比較，外源性膽紅素低、中劑量組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表達(dá)水平均顯著升高，而大鼠高劑量組海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨著外源性膽紅素劑量增加，外源性膽紅素低、中、高劑量組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示，外源性膽紅素通過(guò)調(diào)控p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表達(dá)來(lái)調(diào)控海馬細(xì)胞凋亡。

綜上所述，外源性膽紅素能夠提高缺血缺氧性腦損傷大鼠的認(rèn)知功能，抑制海馬組織細(xì)胞凋亡，這一作用可能是通過(guò)調(diào)控JAK2/STAT3/Bcl-2通路的活性而實(shí)現(xiàn)。