基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建SETD2基因敲除鼻咽癌細(xì)胞株并分析其增殖特性*

王思思， 廖曉敏▲， 邵鐘銘， 袁建玲， 封慕茵， 哈艷平， 李汝佳， 申志華, 揭 偉△

(廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1病理學(xué)系， 2病理生理教研室， 廣東 湛江 524023)

基于非基因組DNA突變的表觀遺傳學(xué)調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)中的重要機(jī)制之一，通過甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化和其它多種修飾方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[1-2]。人類SETD2基因位于第3號(hào)染色體短臂的2區(qū)1帶(3p21.31), 長(zhǎng)度大約為192 kb, 包括23個(gè)外顯子和22個(gè)內(nèi)含子。SETD2蛋白是組蛋白H3第36號(hào)位賴氨酸三甲基化(H3K36me3)轉(zhuǎn)移酶[3]。H3K36me3 作為基因活化標(biāo)志，參與基因轉(zhuǎn)錄起始的抑制、生物的生長(zhǎng)發(fā)育、轉(zhuǎn)錄因子p53的激活及DNA的修復(fù)等眾多生物學(xué)過程。近年發(fā)現(xiàn)SETD2基因在多種人類腫瘤中存在突變，其表達(dá)普遍呈下降趨勢(shì)，具有抑癌基因作用，可能是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[4-6]，但SETD2基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的確切機(jī)制尚不清楚。

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)華南地區(qū)的多發(fā)性惡性腫瘤，具有顯著的流行病學(xué)特征。NPC的發(fā)生、發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果，與遺傳易感性、EB病毒感染及環(huán)境因素等緊密相關(guān)。我們課題組前期就NPC的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)了一些與NPC臨床侵襲、進(jìn)展密切相關(guān)的基因表達(dá)或信號(hào)異常，為進(jìn)一步闡明NPC的發(fā)病學(xué)提供了新的線索[7-12]。迄今，與NPC高度相關(guān)且具有臨床轉(zhuǎn)化意義的分子治療靶點(diǎn)的涉疑基因仍少見。SETD2與NPC的報(bào)道極少[13]， SETD2異常在NPC中的發(fā)生和發(fā)展中是否發(fā)揮作用尚不清楚。

基因組編輯是指對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定向操作，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除或加入等。以ZFN (zinc-finger nucleases)和TALEN (transcription activator-like effector nucleases)為代表的序列特異性核酸酶技術(shù)能夠高效率地進(jìn)行定點(diǎn)基因組編輯, 在基礎(chǔ)研究、基因治療和遺傳改良等方面展示出了巨大的潛力。近來開發(fā)并不斷完善的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白9(CRISPR-associated protein 9, Cas9)技術(shù)是繼ZFN和TALEN之后出現(xiàn)的第3代“基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)”[14-15]，具有高效、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，目前在基因組編輯中受到極大的重視。本研究擬應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，對(duì)高表達(dá)SETD2的NPC細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯獲得SETD2基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞株，初步分析SETD2在NPC增殖中的作用，為后續(xù)深入研究NPC中SETD2的生物學(xué)功能及分子機(jī)制提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞系

永生化鼻咽黏膜上皮細(xì)胞系NP-69、高分化鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、低分化鼻咽癌細(xì)胞系CNE2Z及未分化鼻咽癌細(xì)胞系C666-1均為我室保存。

2 主要試劑及儀器

基于pCRISPR-CG01質(zhì)粒(元件序列：U6-sgRNA-CMV-T7-Cas9-Sv40-mCherry-IRES-Neo)構(gòu)建的含針對(duì)人SETD2基因的CRISPR/Cas9質(zhì)粒及相應(yīng)小向?qū)NA(small guide RNA,sgRNA)均委托GeneCopoeia旗下廣州復(fù)能公司進(jìn)行設(shè)計(jì)和制備。3條sgRNA靶向位點(diǎn)分別為5’-GATGGGGGATTTCTACGACC-3’、 5’-TCTAGTCGATTTTTGCCCAA-3’和5’-GGAGTCGAGTCTACCTGAAG-3’。pCRISPR-CG01質(zhì)粒物理圖譜參見GeneCopoeia相關(guān)網(wǎng)頁。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(HyClone)；NP-69上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液和Lipofectamine 3000(Invitrogen)；蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑、NC膜和ECL發(fā)光液(碧云天)；兔抗人SETD2 I抗(GeneTex)；兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、GAPDH和tubulin I抗(Cell Signaling Technology)；兔抗人細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)、cyclin B1、cyclin E1、cyclin A2、CDK2、CDK4、CDK6、p16、p21 I抗及HRP標(biāo)記的II抗(ProteinTech)；TRIzol試劑(Ambion)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa)；PCR引物(上海生工)。CO2培養(yǎng)箱(BNA-311型，Thermo)；PCR儀(Eppendorf)；轉(zhuǎn)膜儀及水平電泳系統(tǒng)(BioRad)；FACS Canto II型流式細(xì)胞儀(BD)；酶標(biāo)儀(BioTek)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能)。

3 方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) 參考既往方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)[8-11]。簡(jiǎn)言之，NP-69細(xì)胞用含5% 胎牛血清的上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液重懸，接種于6 cm培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3 d換液一次；CNE1、CNE2Z及C666-1細(xì)胞均以含10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液重懸，接種于6 cm培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2天換液1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3.2CRISPR/Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及單克隆細(xì)胞株篩選和鑒定 CNE1細(xì)胞接種12孔板，將3種CRISPR/Cas9質(zhì)?；旌铣蒫ocktail，按Lipofectamine 3000說明書將3 μg混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)至CNE1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下觀察紅色熒光的陽性情況并在孔板背面相應(yīng)位置做好標(biāo)記，將標(biāo)記處的細(xì)胞用0.25%胰酶消化并轉(zhuǎn)移至96孔板，調(diào)整濃度為每孔接種1個(gè)細(xì)胞，待生長(zhǎng)出單克隆細(xì)胞后擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行Western blot鑒定SETD2蛋白表達(dá)。

3.3Western blot 各組細(xì)胞經(jīng)冷PBS洗滌，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，應(yīng)用BCA法定量蛋白濃度。取30～50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜。根據(jù)待檢測(cè)目的蛋白的分子量大小，將NC膜剪成一定大小，各膜經(jīng)含5% BSA的TBST室溫?fù)u床上封閉1 h，TBST洗滌3次后與相應(yīng)I抗4 ℃孵育過夜，各抗體稀釋比例如下： SETD2， 1∶500； PCNA, 1∶500; cyclin D1, 1∶500; cyclin B1, 1∶500; cyclin A2, 1∶500; cyclin E1, 1∶500； CDK2, 1∶500； CDK4, 1∶500； CDK6, 1∶500； p16, 1∶500； p21, 1∶500； Tubulin, 1∶3 000； GAPDH, 1∶500。TBST洗滌3遍，每遍15 min，各膜再與HRP-標(biāo)記IgG室溫下結(jié)合1 h，洗滌后經(jīng)ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描條帶，ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.4RT-PCR TRIzol提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/280以判斷RNA濃度及純度，取500 ng 總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。經(jīng)PCR在線引物設(shè)計(jì)平臺(tái)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)跨外顯子引物。SETD2(NM_014159.6)上游引物序列為5’-CCTCTTCTGCCTATGAGCGG-3’， 下游引物序列為5’-ATGTGGCACCACTGGTACTG-3’，PCR產(chǎn)物434 bp； 內(nèi)參照GAPDH(NM_002046.6)上游引物序列為5’-CCGCATCTTCTTTTGCGTCG-3’， 下游引物序列為5’-TGGAATTTGCCATGGGTGGA-3’，PCR產(chǎn)物217 bp。20 μL PCR體系含PCR 2×buffer 10 μL(含Taq酶及dNTPs)、cDNA 4 μL、引物1.6 μL (含上、下游)和ddH2O 4.4 μL。 PCR循環(huán)參數(shù)： 94 ℃預(yù)變性2 min； 94 ℃ 40 s， 60 ℃ 40 s， 72 ℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，ImageJ軟件分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 細(xì)胞按每孔2×103個(gè)接種于96孔板，過夜孵育貼壁。按貼壁后培養(yǎng)時(shí)間0 h、24 h、48 h及72 h每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃繼續(xù)孵育3 h，酶標(biāo)儀上讀取450 nm的吸光度，每組5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6平板集落形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞按每皿200個(gè)接種于3 cm培養(yǎng)皿，每2 d換液一次，連續(xù)培養(yǎng)14 d。取出培養(yǎng)皿，PBS洗滌1次，4%中性甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS洗滌2次，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌2次。統(tǒng)計(jì)≥50細(xì)胞的克隆數(shù)量并計(jì)算克隆形成率。每組3個(gè)復(fù)孔。

3.7細(xì)胞周期分析 細(xì)胞接種于6孔板，48 h后收獲細(xì)胞，4%冷甲醛固定，PBS洗滌1次， 37 ℃、避光條件下細(xì)胞經(jīng)PI和RNasin處理15 min，采用BD FACS Canto II流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的分布，每組重復(fù)3孔。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同分化狀態(tài)NPC細(xì)胞系中SETD2的表達(dá)

分別應(yīng)用半定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)SETD2基因在不同分化狀態(tài)NPC細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平，結(jié)果顯示，與永生化鼻咽黏膜上皮細(xì)胞系NP-69相比，高分化CNE1細(xì)胞、低分化CNE2Z細(xì)胞及未分化C666-1細(xì)胞中SETD2 mRNA及蛋白水平均呈逐漸下降趨勢(shì)(P<0.01)，尤其是C666-1細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到SETD2 mRNA及蛋白,見圖1。

Figure 1.Detection of SETD2 expression in nasopharyngeal carcinoma cells in various differentiation status by RT-PCR (A) and Wes-tern blot (B). Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NP-69 cells.

2 基于CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除NPC細(xì)胞中的SETD2基因

在明確了CNE1具有較高水平的SETD2表達(dá)后，我們采用CRISPR/Cas9方法對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行SETD2基因組編輯。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，將含SETD2特異性sgRNA的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，在Cas9蛋白酶的作用下實(shí)現(xiàn)對(duì)靶DNA的切割。通過轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中mCherry發(fā)出的紅色熒光，初步篩選出轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞。收集細(xì)胞，再通過有限稀釋法，將轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞接種至96孔板進(jìn)行單克隆細(xì)胞篩選，最終挑選出15個(gè)單克隆細(xì)胞株，再經(jīng)過Western blot檢測(cè)，觀察到#2、#3、#4、#5、#9、#10、#11、#12、#13和#15等10個(gè)單克隆細(xì)胞株具有程度不等的SETD2蛋白水平下降，最終挑選#5和#9克隆作為SETD2基因敲除細(xì)胞，分別標(biāo)記為CNE1-SETD2-KO-#5和CNE1-SETD2-KO-#9，見圖2。以未進(jìn)行編輯的細(xì)胞標(biāo)記為野生型即CNE1-WT。后續(xù)實(shí)驗(yàn)即以這3個(gè)細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

Figure 2.Expression of SETD2 protein in the 15 monoclones of SETD2 knockout cell strains. Mean±SD. n=3.

3 SETD2敲除促進(jìn)了NPC細(xì)胞的活力

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CNE1-SETD2-KO-#5和CNE1-SETD2-KO-#9細(xì)胞的活力均較同一時(shí)點(diǎn)的CNE1-WT細(xì)胞增加(P<0.05)，見圖3A；Western blot結(jié)果證實(shí)，與CNE1-WT細(xì)胞相比，CNE1-SETD2-KO-#5和CNE1-SETD2-KO-#9細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，見圖3B。平板集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，CNE1-SETD2-KO-#5和CNE1-SETD2-KO-#9細(xì)胞的集落形成效率均高于CNE1-WT細(xì)胞(P<0.01)，見圖3C。

Figure 3.SETD2 knockout promotes the proliferation of NPC cells. A: CCK-8 assay was used to examine the viability of CNE1 cells before and after SETD2 knockout; B: Western blot analysis of PCNA protein levels in CNE1 cells before and after SETD2 knockout; C: plate colony forming assay was used to detect the colony formation efficiency of CNE1 cells before and after SETD2 knockout. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 h; ##P<0.01 vs CNE1-WT.

4 敲除SETD2后干擾了NPC細(xì)胞周期分布

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示，與CNE1-WT細(xì)胞相比，CNE1-SETD2-KO-#5和CNE1-SETD2-KO-#9細(xì)胞G1期比例均下降(P<0.01)，而S期和G2/M期比例也有一定水平的升高(P<0.05)，見圖4。

5 敲除SETD2后干擾了NPC細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，SETD2基因敲除后CNE1-SETD2-KO-#5和CNE1-SETD2-KO-#9克隆中cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4的表達(dá)增加，p21的表達(dá)減少(P<0.05)， CDK6和p16表達(dá)改變不明顯，見圖5。

討 論

SETD2基因是編碼H3K36me3轉(zhuǎn)移酶的唯一基因，具有重要的生物學(xué)功能[3]。SETD2在DNA修復(fù)，染色體分離和RNA剪接過程中發(fā)揮作用[16-18]。在多數(shù)人類腫瘤中均檢測(cè)到SETD2基因存在突變的情況[19]。迄今，SETD2基因表達(dá)異常在腎細(xì)胞癌[20- 21]、乳腺癌[22]、骨肉瘤[23]、胃癌[24]、淋巴瘤[25]、白血病[26]和肺癌[27]等均有報(bào)道。SETD2基因作為潛在抑癌基因，其低表達(dá)與腫瘤預(yù)后相關(guān)，因而深入了解SETD2基因在人類腫瘤中的表達(dá)及失常機(jī)制對(duì)腫瘤的靶向治療具有重要的意義。

Figure 4.Flow cytometry analysis of cell cycle distribution. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs CNE1-WT.

Figure 5.The expression of cell cycle-related proteins. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs CNE1-WT.

截止目前只有1篇有關(guān)SETD2與NPC的報(bào)道。研究表明，臨床轉(zhuǎn)移組NPC組織較未轉(zhuǎn)移組NPC組織中SETD2 mRNA水平下降[13]，初步從流行病學(xué)角度提示了SETD2在NPC臨床進(jìn)展中的作用，但缺乏具體分子機(jī)制的探索。為了解SETD2在NPC中的確切作用，我們首先對(duì)臨床NPC標(biāo)本中的SETD2蛋白進(jìn)行了免疫組化的檢測(cè)，結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)照的鼻咽黏膜慢性炎癥組織，NPC腫瘤細(xì)胞中SETD2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(未發(fā)表資料)，這一表達(dá)趨勢(shì)與前述多種人類腫瘤中SETD2蛋白表達(dá)下降的趨勢(shì)是一致的。隨后，以永生化鼻咽黏膜上皮細(xì)胞系NP-69為對(duì)照，對(duì)不同分化程度的NPC細(xì)胞系進(jìn)了SETD2轉(zhuǎn)錄及翻譯產(chǎn)物的檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)隨著分化程度的下降， SETD2的表達(dá)亦呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，初步提示了SETD2與NPC腫瘤細(xì)胞惡性行為負(fù)相關(guān)。我們以SETD2表達(dá)水平最高的高分化NPC細(xì)胞系CNE1為對(duì)象，采用基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)，對(duì)CNE1細(xì)胞中SETD2基因進(jìn)行敲除，最后從15個(gè)轉(zhuǎn)染了SETD2 特異sgRNA的單克隆細(xì)胞中成功篩選出2個(gè)SETD2敲除單克隆作為后續(xù)研究的對(duì)象。本研究采用GeneCopoeia新開發(fā)的pCRISPR-CG系列sgRNA表達(dá)載體不僅可表達(dá)sgRNA，還可同時(shí)表達(dá)Cas9核酸內(nèi)切酶，因此操作簡(jiǎn)便。SETD2基因敲除NPC細(xì)胞株的成功構(gòu)建可為其生物學(xué)功能研究提供了基礎(chǔ)。

對(duì)SETD2基因敲除前后的細(xì)胞進(jìn)行增殖相關(guān)特性的分析表明，無論是檢測(cè)短期效應(yīng)的CCK-8實(shí)驗(yàn)還是評(píng)估長(zhǎng)期效應(yīng)的平板集落形成實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果均證實(shí)SETD2敲除后細(xì)胞活力得以增加，并在分子水平上也觀察到PCNA這一反映細(xì)胞增殖能力的蛋白表達(dá)水平也被上調(diào)。細(xì)胞周期分布上，SETD2基因敲除后顯著減少了G1期但增加S期及G2/M期分布。從分子水平上，觀察到SETD2基因敲除后顯著增加了cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4的表達(dá)，明顯減低了p21的表達(dá)。細(xì)胞周期素、細(xì)胞周期素激酶及細(xì)胞周期素激酶抑制因子的協(xié)調(diào)表達(dá)是介導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)展的核心機(jī)制。已有報(bào)道，SETD2通過與p53作用進(jìn)而影響多個(gè)下游基因如p21的表達(dá)[28]，本項(xiàng)試驗(yàn)再次證實(shí)了SETD2對(duì)p21的調(diào)節(jié)作用。然而，一項(xiàng)有關(guān)肌母細(xì)胞C2C12的研究中指出，SETDE2敲除后導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降，表現(xiàn)為p21表達(dá)的上調(diào)及G1/S和G2/M周期轉(zhuǎn)換的障礙[29]，這一結(jié)論與本研究恰好相反，提示了SEDT2對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用可能具有細(xì)胞類型的差異性。新近的一項(xiàng)研究也指出，SETD2基因是進(jìn)化上保守的細(xì)胞周期調(diào)控基因，其突變可能是人類腫瘤發(fā)生的機(jī)制之一[30]。本研究首次證實(shí)，SETD2缺失可從多個(gè)細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)水平影響NPC細(xì)胞周期的進(jìn)展。

SETD2除了參與組蛋白修飾，還可修飾其他非組蛋白基因，如曹雪濤課題組新近發(fā)現(xiàn)SETD2可調(diào)節(jié)STAT1甲基化而參與IFNα依賴的抗病毒免疫[31]。由此可見，進(jìn)一步闡明SETD2對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的下游靶基因，對(duì)疾病的防治具有重要的意義。

總之，本研究結(jié)果提示NPC細(xì)胞系中SETD2表達(dá)呈普遍降低的趨勢(shì)，且SETD2基因缺失從多個(gè)分子水平上影響了細(xì)胞周期的分布，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖潛能?；贑RISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯對(duì)NPC中SETD2基因的定點(diǎn)編輯具有可行性，這為后續(xù)深入研究SETD2的功能提供了參考資料。