楊 洲, 剛海菊, 覃先蓬, 賈貴清, 王 波, 楊 春, 趙高平
(1四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院胃腸外科, 2成都職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護分院, 四川 成都 610000)
結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,近年的總體發(fā)病率呈現(xiàn)出上升的趨勢,且大部分患者在確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移,能夠接受根治性手術(shù)的患者,亦有半數(shù)最終發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,因此,大多數(shù)患者需進行術(shù)后化療[1-2]。鉑類是結(jié)直腸癌化療常用的藥物,順鉑(cisplatin)在鉑類中有較廣泛的應(yīng)用,但具有一定的毒副作用,因此提高結(jié)直腸癌對順鉑的化療敏感性備受研究者關(guān)注。Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)是Krüppel樣因子家族中的一個成員,人KLF4基因定位于9q31,具有調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、分化及維持機體組織穩(wěn)態(tài)等多種重要的功能,在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用,如在結(jié)直腸癌、肺癌等腫瘤中具有抑癌樣作用,而在口腔鱗癌等腫瘤中表達升高,發(fā)揮促癌樣作用[3-5]。有研究發(fā)現(xiàn)抑制骨肉瘤中KLF4的表達可增加順鉑對腫瘤的化療敏感性[6];重組人KLF4可以提高肝癌細胞的順鉑化療耐受性[7]。目前已證實,KLF4是消化道上皮的重要抑癌基因[8-9],但其對結(jié)直腸癌生物學(xué)特性及是否可增加順鉑化療敏感性還未清楚。本研究通過過表達KLF4,檢測其對結(jié)直腸癌細胞活力、凋亡及順鉑化療敏感性的影響,并探討其可能的分子機制。
胎牛血清購自Gibco;RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone;脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen; CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所;膜聯(lián)蛋白V-FITC/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡試劑盒購自南京凱基;Bradford試劑盒購自上海生工;抗KLF4、p-IκBα、細胞周期素D1(cyclin D1)和生存素(survivin)抗體均購自Santa Cruz。MK3酶標儀(Thermo);Bio-Plex200流式細胞儀(BioRad)。
2.1細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸黏膜上皮NCM460細胞及結(jié)直腸癌Caco2、SW480和HCT116細胞均購自中國科學(xué)院上海細胞庫。細胞在37 ℃解凍后,置于5%體積分數(shù)的CO2培養(yǎng)箱中用含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期的細胞用于實驗研究。
2.2pcDNA3.1-KLF4轉(zhuǎn)染SW480細胞 細胞轉(zhuǎn)染分為對照(control)組(僅加入脂質(zhì)體)、pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒)和pcDNA3.1-KLF4組(轉(zhuǎn)染構(gòu)建的pcDNA3.1-KLF4過表達質(zhì)粒),轉(zhuǎn)染方法參照LipofectamineTM2000產(chǎn)品說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 d接種SW480細胞(每孔2.5×105)于6孔板,每孔加入1 mL,細胞生長融合達60%~75%時,更換培養(yǎng)液(不含血清及抗生素),按照上述分組參照轉(zhuǎn)染說明進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5~6 h,換為含血清和無抗生素培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,Wes-tern blot檢測各組細胞中KLF4的表達。
2.3Western blot實驗 在生長至對數(shù)期的NCM460、Caco2、SW480、HCT116細胞及各處理組的SW480細胞中加入適量的RIPA細胞裂解液,于冰上裂解反應(yīng)30 min,離心收集上清液,上清即為提取的總蛋白,Bradford法檢測蛋白濃度??偟鞍鬃冃蕴幚砗笕?0 μg上樣,SDS-PAGE分離蛋白后通過半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫條件下封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜1 h,洗膜,4 ℃搖床孵育皆按照1∶1 000稀釋的抗KLF4、p-IκBα、cyclin D1和survivin抗體過夜,洗膜,加入HRP標記的山羊抗兔 II 抗,ECL發(fā)光劑顯影,掃描膠片后用圖像分析軟件測定各蛋白條帶的灰度值,以GAPDH作為內(nèi)參照計算KLF4、p-IκBα、cyclin D1和survivin的相對蛋白量。
2.4CCK-8法檢測細胞活力 以每孔5 000個細胞接種生長至對數(shù)期的SW480細胞于96孔板,培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h進行同步化處理,將pcDNA3.1-KLF4和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染SW480細胞,并設(shè)置空白對照組,每組均設(shè)置5個平行孔,轉(zhuǎn)染方法同2.2,轉(zhuǎn)染48 h后吸出培養(yǎng)基,pcDNA3.1-KLF4組加入1 mg/L順鉑,,實驗分為pcDNA3.1、pcDNA3.1-KLF4和pcDNA3.1-KLF4+順鉑,順鉑處理48 h后,在各組的每孔細胞中加入CCK8試劑10 μL,酶標儀測定450 nm處吸光度(A)值。實驗重復(fù)3次。
2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 采用Annexin V-FITC和PI雙染法。消化收集參照2.4分組處理的3組細胞,預(yù)冷的PBS洗滌細胞,binding緩沖液重懸細胞,分別加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI,室溫避光環(huán)境反應(yīng)10~15 min,流式細胞儀進行檢測。實驗重復(fù)3次。
2.6活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量的檢測 PBS洗滌參照2.4分組處理的3組細胞,懸浮細胞于含有終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA的無血清培養(yǎng)液中,培養(yǎng)箱37 ℃避光條件孵育1 h,孵育完畢用不含血清培養(yǎng)基洗滌細胞,將細胞懸液濃度調(diào)整為2×108,取10 μL細胞懸液加到載玻片上,蓋片。將玻片固定在激光共聚焦顯微鏡載物臺上,熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及細胞內(nèi)DCF熒光分布及強度變化。實驗重復(fù)3次。
所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行分析,計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,多組差異比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
Western blot檢測結(jié)果顯示,與人正常結(jié)腸NCM460細胞相比,結(jié)直腸癌Caco2、SW480和HCT116細胞中KLF4的蛋白表達均顯著降低(P<0.05),見圖1。
Figure 1.The protein expression of KLF4 in the colorectal can-cer cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NCM460 cells.
pcDNA3.1組KLF4的蛋白表達與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義, pcDNA3.1-KLF4組KLF4的蛋白表達顯著高于對照組(P<0.05),見圖2。
Figure 2.The effect of pcDNA3.1-KLF4 transfection on the expression of KLF4 in the SW480 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.
以A值反映細胞活力,間接反映出細胞的增殖能力,CCK8法檢測結(jié)果顯示,pcDNA3.1-KLF4組的細胞活力顯著低于pcDNA3.1組(P<0.05),而pcDNA3.1-KLF4+順鉑組的細胞活力顯著低于pcDNA3.1-KLF4組(P<0.05),見圖3。
Figure 3.Transfection of pcDNA3.1-KLF4 increased the inhibitory effect of cisplatin on the viability of SW480 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group; #P<0.05 vs pcDNA3.1-KLF4 group.
pcDNA3.1-KLF4組的細胞凋亡率顯著高于pcDNA3.1組(P<0.05),而pcDNA3.1-KLF4+順鉑組的細胞凋亡率顯著高于pcDNA3.1-KLF4組(P<0.05),見圖4。
Figure 4.Transfection of pcDNA3.1-KLF4 increased cisplatin-induced apoptosis of SW480 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group; #P<0.05 vs pcDNA3.1-KLF4 group.
細胞內(nèi)的ROS水平與檢測的熒光強度呈現(xiàn)出正相關(guān)。pcDNA3.1-KLF4組的ROS含量顯著高于pcDNA3.1組(P<0.05),而pcDNA3.1-KLF4+順鉑組的ROS含量顯著高于pcDNA3.1-KLF4組(P<0.05),見圖5。
Western blot檢測各組細胞中NF-κB信號通路關(guān)鍵分子IκBα的磷酸化水平及下游蛋白cyclin D1和survivin的表達,結(jié)果顯示, pcDNA3.1-KLF4組的p-IκBα蛋白水平顯著高于pcDNA3.1組,cyclin D1和survivin的蛋白水平顯著低于pcDNA3.1組(P<0.05);而pcDNA3.1-KLF4+順鉑組的p-IκBα蛋白水平顯著高于pcDNA3.1-KLF4組,cyclin D1和survivin的蛋白表達顯著低于pcDNA3.1-KLF4組(P<0.05),見圖6。
多項研究顯示,一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、原癌基因和抑癌基因等與結(jié)直腸癌的化療敏感性密切相關(guān),并取得了一定的成果[10-12],但結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的確切機制還未清楚。KLF4在腫瘤中具有雙向功能,有癌基因或抑癌基因樣作用,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后等有密切聯(lián)系[13]。有研究顯示,肺癌中敲減KLF4的表達可促進癌細胞的生長,而過表達KLF4可抑制癌細胞的生長[14];過表達KLF4的白血病細胞生長受到抑制,凋亡增加[15]。目前也有多項研究證實KLF4參與胃腸道腫瘤形成,有研究顯示,胃癌中KLF4表達水平降低,其表達與胃癌的分化程度及進展呈現(xiàn)出正相關(guān),可促進胃癌增殖[16-17];結(jié)腸癌中過表達KLF4可抑制癌細胞生長和侵襲,并誘導(dǎo)細胞凋亡,將過表達KLF4基因種植到裸鼠體內(nèi),也可明顯降低腫瘤大小[18-19]。因此,KLF4表達可作為胃癌和結(jié)腸癌預(yù)后判斷的一項獨立指標。結(jié)直腸癌中KLF4是否可增強化療敏感性還未明確。
Figure 5.The effect of pcDNA3.1-KLF4 transfection on the content of ROS in the SW480 cells treated with cisplatin (×200). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group; #P<0.05 vs pcDNA3.1-KLF4 group.
本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細胞中KLF4的表達均明顯降低,這與前人的研究結(jié)果是一致的,提示KLF4對結(jié)直腸癌的負向調(diào)控作用。將過表達KLF4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細胞,發(fā)現(xiàn)過表達KLF4后結(jié)直腸癌細胞的活力受到抑制,凋亡增加,且可增加順鉑對結(jié)直腸癌活力的抑制和凋亡的促進作用。這提示過表達KLF4可增加順鉑對結(jié)直腸癌的順鉑化療敏感性。
ROS可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體途徑引起細胞的凋亡,是細胞發(fā)生凋亡的重要促進因子。低水平ROS可參與調(diào)節(jié)細胞的正常生理功能,而細胞內(nèi)大量的ROS的積聚可引起細胞的凋亡[20-21]。有研究顯示,結(jié)直腸癌中ROS水平參與了癌細胞的凋亡[22]。NF-κB可參與腫瘤、免疫等過程,大多數(shù)情況下NF-κB是無活性狀態(tài),當受到刺激后,可引起IκBɑ發(fā)生磷酸化,磷酸化的IκBɑ與NF-κB分離,NF-κB游離出來而釋放入核而后行使轉(zhuǎn)錄因子功能,誘導(dǎo)一些靶基因的表達,如cyclin D1、survivin、Bcl-2等[23-24]。有研究顯示,異?;罨腘F-κB與一些腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系[25-26]。結(jié)直腸癌中NF-κB的含量增多,其表達與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān),異?;罨腘F-κB信號可促進結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。但也有研究發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB信號可降低結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[27-28]。過表達KLF4是否可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展還未清楚。本研究結(jié)果顯示,過表達KLF4后ROS含量明顯升高, IκBɑ的磷酸化水平升高,并可抑制靶基因cyclinD1和survivin的表達,提示KLF4對結(jié)直腸癌細胞活力和凋亡的影響可能與提高細胞內(nèi)ROS含量及抑制NF-κB信號通路有關(guān)。
綜上所述,上調(diào)結(jié)直腸癌細胞KLF4基因表達可降低癌細胞活力、誘導(dǎo)細胞凋亡及增加順鉑化療敏感性,其機制可能與提高細胞內(nèi)ROS含量及下調(diào)NF-κB信號通路有關(guān)。該研究可能為結(jié)直腸癌治療提供了新的途徑,但還需更多研究理論及臨床試驗證實。
Figure 6.The effect of pcDNA3.1-KLF4 transfection on protein levels of NF-κB signaling pathway-related molecules in the SW480 cells treated with cisplatin. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group; #P<0.05 vs pcDNA3.1-KLF4 group.