改良法制備大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型

宋娟 李清漪 張奇 崔紅霞 關(guān)寶生 趙玉杰 李萍 宋志斌

[摘要]目的 改良方法建立大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。方法 將16只雄性大鼠隨機(jī)分為空白對照組和模型組，每組8只。于大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)后側(cè)沿跟腱內(nèi)側(cè)以30°～40°方向進(jìn)針復(fù)制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，模型組注射尿酸鈉溶液（25 mg/ml），空白對照組注射生理鹽水，以關(guān)節(jié)囊對側(cè)鼓起為注入標(biāo)準(zhǔn)。觀察各組大鼠一般情況，測量給藥前及給藥后12、24、36、48 h大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)周長并計(jì)算腫脹指數(shù)。結(jié)果 模型組各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的關(guān)節(jié)腫脹度均高于空白對照組（P<0.01）。結(jié)論 改良方法制備的大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，造模后24 h踝關(guān)節(jié)腫脹度達(dá)到高峰，可維持至48 h，穩(wěn)定性好。

[關(guān)鍵詞]痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；大鼠；模型；改良

[中圖分類號] R965.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）11（a）-0004-03

Preparation of gouty arthritis model in rats by modified method

SONG Juan1 LI Qing-yi1 ZHANG Qi1 CUI Hong-xia1 GUAN Bao-sheng2 ZHAO Yu-jie2 LI Ping1 SONG Zhi-bin1

1. School of Pharmacy， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Province， Qiqihar 161006， China； 2. College of Public Health， Jiamusi University， Heilongjiang Province， Jiamusi 154000， China

[Abstract] Objective To build the model of acute gouty arthritis by a modified method in rats. Methods A total of 16 male rats were randomly divided into the blank control group and the model group， with 8 cases in each group， through palm of right ankles and along the heel tendon back from 30 to 40 degrees Celsius direction into the needle， the model group was injected Uric Acid Sodium Solution （25mg/ml）， the blank control group was injected normal saline， the opposite side of the joint capsule bulged was used as the injection standard. The general situation of rats were observed in each group， the circumference of the right ankle joint were measured and the swelling index of the right ankle joint of the rats were calculated before and after the administration of the drug at 12， 24， 36， 48 h. Results The joint swelling of each time node in the model group was higher than that in the blank control group （P<0.01）. Conclusion The degree of joint swelling in the model of gout arthritis in rats with modified method is highest at 24 h after modeling， and can be maintained to 48 h with good stability.

[Key words] Gouty arthritis； Rats； Model； Modify

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（gouty arthritis，GA）是因單鈉尿酸晶體沉積在關(guān)節(jié)周圍組織而引起的急性炎癥反應(yīng)，是痛風(fēng)的主要臨床表現(xiàn)。隨著人們生活水平的提高，日常飲食中糖、脂肪、蛋白質(zhì)等比重逐漸增大，GA的發(fā)病率呈上升且低齡化趨勢[1]。飲酒、高嘌呤飲食等是誘發(fā)GA急性發(fā)作的主要因素，長期反復(fù)發(fā)作可發(fā)展為慢性痛風(fēng)，導(dǎo)致痛風(fēng)石、尿路結(jié)石、關(guān)節(jié)畸形、痛風(fēng)性腎病等，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，因此，制備穩(wěn)定GA模型對痛風(fēng)治療藥物研發(fā)至關(guān)重要[2]。多數(shù)研究者制備GA模型的方法是Coderre穿刺法[3]，其缺點(diǎn)是易卡針造成關(guān)節(jié)損傷且給藥體積有限。本研究參考呂軍等[4]的造模方法，調(diào)整給藥劑量，誘導(dǎo)大鼠GA模型，旨在為GA模型制備和篩選提供更多的理論依據(jù)。

1對象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠16只，平均體重為（180±20）g，雄性，動(dòng)物使用許可證號為SYXK（黑）2016-001，質(zhì)量合格證號為No.23001800000249，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)期間室溫20～25℃，濕度40%～50%，自然晝夜節(jié)律。

1.2主要儀器與試劑

MSU晶體（美國sigma公司，批號：BCBS7438），吐溫80（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號：20170108），生理鹽水（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，批號：171002D11），戊巴比妥鈉（北京普博斯生物科技有限公司，批號：20171201）。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理

無菌條件下，將1250 mg尿酸鈉結(jié)晶加45 ml生理鹽水，再加5 ml吐溫80，加熱攪拌，配制成50 ml尿酸鈉溶液。

16只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對照組和模型組，每組8只。參照呂軍等[4]提出的改良模型方法進(jìn)行造模，各組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.5 ml/100 g麻醉，將麻醉后大鼠的右側(cè)踝關(guān)節(jié)固定至90°，常規(guī)消毒后，用6號注射針于右側(cè)踝關(guān)節(jié)后側(cè)沿跟腱內(nèi)側(cè)以30°～40°方向進(jìn)針，模型組大鼠注射200 μl尿酸鈉溶液（25 mg/ml），空白對照組大鼠注射生理鹽水200 μl于關(guān)節(jié)囊中，以對側(cè)關(guān)節(jié)囊鼓起為注入標(biāo)準(zhǔn)。

1.4觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中，觀察并記錄各組大鼠造模前后飲食、體重、毛發(fā)、精神狀態(tài)、步態(tài)等變化。參照文獻(xiàn)評定大鼠步態(tài)[5-6]，判斷標(biāo)準(zhǔn)如下。0級：正常行走，四足均勻著地；Ⅰ級：輕度跛行，右后肢略彎曲；Ⅱ級：明顯跛行，右后足剛觸及地面；Ⅲ級：右后足完全離地，三足著地行走。

1.4.2踝關(guān)節(jié)腫脹度檢查 觀察各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度變化。標(biāo)記大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)受試部位，保證每次測量位置相同。采用縛線法測量各組大鼠踝關(guān)節(jié)造模前及造模后12、24、36、48 h的周長，并計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度。關(guān)節(jié)腫脹度=（測定周長-原始周長）/原始周長。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況比較

實(shí)驗(yàn)前各組大鼠精神狀態(tài)好，活潑好動(dòng)，食欲良好，皮毛有光澤。實(shí)驗(yàn)期間空白對照組大鼠與實(shí)驗(yàn)前狀態(tài)無明顯差異；踝關(guān)節(jié)注射尿酸鈉溶液后模型組大鼠精神萎靡，飲食逐漸減少，行動(dòng)遲緩，皮毛發(fā)黃。給藥后觀察12～24 h，模型組大鼠活動(dòng)、飲食明顯減少，關(guān)節(jié)局部膚溫升高，模型組較實(shí)驗(yàn)前變化顯著?？瞻讓φ战M8只大鼠步態(tài)均為0級，模型組8只步態(tài)呈現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級分別為4、3、1只，無0級步態(tài)。

2.2各時(shí)間節(jié)點(diǎn)踝關(guān)節(jié)腫脹度的比較

模型組和空白對照組大鼠造模前踝關(guān)節(jié)直徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模后，模型組在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)關(guān)節(jié)腫脹度均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示模型制備成功。

3討論

GA是因尿酸鈉晶體沉積于關(guān)節(jié)滑膜等組織而引起的急性無菌性炎癥，是痛風(fēng)的主要臨床表現(xiàn)。GA發(fā)病存在明顯的地域差異性和家族聚集性，患者關(guān)節(jié)腫脹疼痛，嚴(yán)重者關(guān)節(jié)畸形，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[7]，因此，建立穩(wěn)定GA模型進(jìn)行相關(guān)治療藥物的篩選是研究此類疾病的基礎(chǔ)。相關(guān)研究顯示[8-11]，痛風(fēng)患者關(guān)節(jié)部位沉積的尿酸鈉晶體是造成GA的關(guān)鍵因素，尿酸鈉可激活細(xì)胞炎性體NALP3，從而激活前體IL-1β和前體IL-18促發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，引起局部血管通透性增加、滲出、水腫、發(fā)熱等炎癥反應(yīng)。

目前GA動(dòng)物模型的造模方法較多，具體如下。①單純性GA模型：Coderre等將外源性尿酸鈉溶液直接注射入動(dòng)物關(guān)節(jié)腔內(nèi)，模擬GA局部癥狀。但有研究顯示，大鼠與人體的踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)存在差異[4，12]，大鼠距骨與跟骨為一體，后側(cè)間隙較前側(cè)間隙寬大，因此經(jīng)典法前側(cè)間隙進(jìn)針，破壞踝關(guān)節(jié)部位軟骨組織，可誘發(fā)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生，易造成卡針及人為關(guān)節(jié)損傷，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用外源性尿酸鈉直接誘導(dǎo)GA局部癥狀，和GA的自然發(fā)病病程有所差異，未涉及痛風(fēng)生化基礎(chǔ)高尿酸血癥的改變，目前已證實(shí)尿酸鈉是GA重要的致炎因子，其誘發(fā)的炎癥反應(yīng)屬非特異性炎癥反應(yīng)，與人類因長期嘌呤代謝障礙而導(dǎo)致的GA有異[13-14]。模型僅適用于藥物對局部關(guān)節(jié)癥狀、組織學(xué)形態(tài)的療效觀察，不能進(jìn)行藥物作用機(jī)制的研究。②伴高尿酸血癥性GA模型：呂軍等[4，6，15，18]在高血尿酸的基礎(chǔ)上結(jié)合藥物或物理方法制備GA模型。③其他模型：熊輝[19]等模擬中醫(yī)濕熱蘊(yùn)結(jié)型制備GA動(dòng)物模型。急性GA動(dòng)物模型制備方法比較見表2。

本實(shí)驗(yàn)利用改良方法，調(diào)整給藥劑量，建立大鼠GA模型，誘發(fā)大鼠踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，病理變化與痛風(fēng)急性發(fā)作時(shí)表現(xiàn)的紅腫熱痛等趨勢一致，空白對照組注射等量生理鹽水后在12 h時(shí)出現(xiàn)腫脹，12 h后腫脹度迅速下降。模型組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度在24 h達(dá)到高峰，可維持至48 h。

綜上所述，改良方法制備的急性GA大鼠模型有穩(wěn)定性好、可控性高、操作簡單、損傷小等優(yōu)點(diǎn)，能夠減少軟骨損傷造成的創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，但由于此模型屬于非特異性炎癥模型，還需進(jìn)一步研究建立符合人類自然病程的動(dòng)物模型。

[參考文獻(xiàn)]

[1]石白，殷海波，張錦花.痛風(fēng)現(xiàn)代流行病學(xué)及其發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2012，1（6）：51-55.

[2]程希，蔣學(xué)華.虎杖與茵陳不同配比對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的影響及部分機(jī)制研究[J].中藥藥理與臨床，2017，33（6）：102-105.

[3]Coderre TJ，Wall PD.Ankle joint urate arthritis （AJUA） in rats：an alternative animal model of arthritis to that produced by Freund′s adjuvant[J].Pain，1987，28（3）：379-393.

[4]呂軍，方和金，吳濤.一種改進(jìn)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型制備方法[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（18）：17-21.

[5]Chen SY，Chen CL，Shen ML，et al.Clinical features of familial gout and effects of probable genetic association between gout and its related disorders[J].Metabolism，2001，24（18）：17-21.

[6]姚麗，劉樹民，于書儀.痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的改良[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2009，17（3）：210-248.

[7]李丹，張劍勇.痛風(fēng)現(xiàn)代流行病學(xué)及降尿酸藥物研究進(jìn)展[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2016，5（4）：73-76.

[8]謝蓓蓓，蘇厚恒.MSU晶體介導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥機(jī)制[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2013，7（16）：7518-7520.

[9]Terkeltaub R，Sundy JS，Schumacher HR，et al.The interleukin 1 inhibitor rilonacept in treatment of chronic gouty arthritis：results of a placebo-controlled，monosequence crossover，non-randomised，single-blind pilot study[J].Ann Rheum Dis，2009，68（10）：1613-1617.

[10]華亮，周蜜.清熱除濕通絡(luò)法對大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型中NALP3炎性體表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018， 33（4）：1591-1594.

[11]楊玲玲，黃麗貞，鄧家剛.痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].世界中醫(yī)藥，2015，10（9）：1461-1463.

[12]柴文新，施合歡，金雯麗，等.一種改良方法制備大鼠痛風(fēng)模型及其炎癥和疼痛效應(yīng)評價(jià)[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2017，23（10）：730-736.

[13]Pascual E，Pedraz T.Gout[J].Curr Opin Rheumatol，2004， 16（3）：282-286.

[14]何泳龍，青玉鳳，周京國.高尿酸血癥及痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型及其中藥復(fù)方治療概況[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015， 30（4）：574-578.

[15]時(shí)樂，徐立，尹蓮，等.冷水泳浴對高尿酸血癥模型大鼠誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的影響[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2012，26（1）：25-29.

[16]Fujiwara K，Ohkawara S，Takagi K，et al.Involvement of CXC chemokine growth-related oncogene-alpha in monosodium urate crystal-induced arthritis in rabbits[J].Lab Invest，2002，82（10）：1297-1304.

[17]李澤，張記恩，榮俊.痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型制備的研究[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)（自科版），2013，10（15）：9-12.

[18]孫賽君，袁卉，蔣金鵬，等.次黃嘌呤灌胃加冰敷法誘導(dǎo)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)（自科版），2014，11（9）：38-40.

[19]熊輝，曲良燁，向黎黎，等.痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證病證結(jié)合模型的建立[J].中醫(yī)正骨，2014，26（3）：14-20.

[20]郭玉星，熊輝.改良痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的復(fù)制[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，40（2）：18-23.

（收稿日期：2018-05-09 本文編輯：祁海文）