一菌雙酶法轉(zhuǎn)化富馬酸生成β－丙氨酸

陳明亮，祁 瑛，肖延銘，華 超，李敬亞，梁阿朋

（1．長興制藥股份有限公司 工業(yè)生物催化與轉(zhuǎn)化浙江省工程研究中心，浙江 長興313100；2．鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，河南 鄭州450001）

L－天冬氨酸（L－Aspartic acid）是一種常見的酸性氨基酸，在醫(yī)藥、食品、美容、化工和材料等方面具有非常廣泛的用途［1－2］。以L－Asp為原料合成的阿斯巴甜和紐甜，適用于兒童、孕婦、哺乳期婦女以及肥胖、心血管病和糖尿病患者在內(nèi)的所有人群［3－4］。L－Asp還參與鳥氨酸循環(huán)，可用作氨解毒劑、肝機能促進劑和疲勞恢復(fù)劑等藥品以及食品添加劑［5］。工業(yè)生產(chǎn)L－Asp主要是由天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（L－Aspar－tase，EC4．3．1．1，AspAT）催化富馬酸加氨合成，具有酶活力高、工藝簡潔和設(shè)備投資少等優(yōu)勢，是當(dāng)今生產(chǎn) L－Asp的主流工藝［6－7］。β－Ala是自然界中唯一存在的β－型氨基酸，也是一種非蛋白氨基酸，存在于某些細(xì)菌、真菌和植物中［8］。β－Ala及其衍生物在醫(yī)藥、食品和化工等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)藥方面，β－Ala用于合成泛酸、泛酸鈣、肌肽、帕米膦酸鈉和巴柳氮等［9］；在化工方面應(yīng)用于電鍍、鉛中毒解毒劑及合成甜味劑［10］。國內(nèi)外β－Ala的生產(chǎn)主要以化學(xué)合成法為主［11］，即以丙烯酸或丙烯腈為底物進行合成，此法生產(chǎn)過程中消耗大量能量，同時對環(huán)境和生物體都有一定的毒害作用。另一種生產(chǎn)方法是生物合成法，利用L－天冬氨酸α－脫羧酶（L－aspartateα－decarboxylase，EC4．1．1．11，PanD）、以 LAsp為底物催化生成β－Ala［12］，此法專一性高且環(huán)保，缺點是L－Asp價格偏高。L－天冬氨酸α－脫羧酶催化L－天冬氨酸脫去α位的羧基生成β－Ala，是生物體內(nèi)泛酸合成中重要的酶。酶法制備β－Ala的研究中，江南大學(xué)高宇通過偶聯(lián)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和L－天冬氨酸α脫羧酶直接以富馬酸和氨為底物合成β－Ala，且產(chǎn)量達(dá)到9．8g／L［13］。

本研究將天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和L－天冬氨酸α脫羧酶構(gòu)建于同一個載體質(zhì)粒上，并導(dǎo)入大腸桿菌宿主進行表達(dá)，使得一次發(fā)酵即可得到兩種酶。而后通過細(xì)胞通透處理和固定化細(xì)胞技術(shù)［14］，使得發(fā)酵獲得的酶可重復(fù)使用多次。該方法獲得的酶可直接以廉價的富馬酸和氨水為底物合成β－Ala，整個反應(yīng)體系中無中間產(chǎn)物L(fēng)－Asp積累，既簡化了生產(chǎn)方法，又降低了生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1．1 材 料

1．1．1 菌株與培養(yǎng)基

大腸桿菌K12MG1655亞菌株（Escherichiacoli K12substrain MG1655），谷氨酸棒桿菌 ATCC 13032（Corynebacterium glutamicum ATCC 13032），E．coli DH5α，E．coli BL21（DE3）和pRSFDuet－1均由本公司保藏。

LB／Kana培養(yǎng)基：蛋白胨10g／L，酵母提取物5g／L，NaCl 5g／L。調(diào)節(jié)pH 至7．2，121 ℃滅菌20min。待培養(yǎng)基冷卻至40～50℃，添加事先配制并過濾除菌后的卡那霉素（Kana），使其終質(zhì)量濃度為50μg／mL。

TB／Kana培養(yǎng)基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，各組分溶解于0．9L水中，121℃滅菌20min。待其冷卻到40～50℃，加入100mL滅菌后含有0．17mol／L KH2PO4和0．72mol／L K2HPO4的溶液，并添加事先配制好的過濾除菌后的卡那霉素溶液，使培養(yǎng)基最終質(zhì)量濃度為50μg／mL。

1．1．2 生化試劑

富馬酸、氨水、NaH2PO4和Na2HPO4購自國藥化學(xué)試劑有限公司，L－天冬氨酸和β－丙氨酸購自阿拉丁，蛋白胨和酵母粉購自O(shè)xoid，其余均為市售分析純。

1．2 方 法

1．2．1 菌種構(gòu)建

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中大腸桿菌K12MG1655亞菌株的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因序列和谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的L－天冬氨酸α－脫羧酶PanD 基因序列分別設(shè)計引物，正向引物 AspAT－F－BamHI：5’－CGCGGATCCATGTTTGAGAACATTACCGC－3’，PanD－F－NdeI： 5’－GGAATTCCATATGCTGCGCACCATCCTCGGAAG－3’；反 向引物 AspAT－RNotI： 5’－ATAAGAATGCGGCCGCCAGCACTGCCACAATCGCTTC－3’， PanD－R－XhoI： 5’－CCGCTCGAGCTAAATGCTTCTCGACGTCA－3’（下劃線部分為限制性酶切位點）。分別挑取Escherichiacoli K12MG1655 和 Corynebacterium glutamicumATCC 13032單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14h后，收集菌體提取基因組，以此基因組為模板分別進行PCR，得到AspAT和PanD基因序列，擴增程序如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72 ℃延伸（AspAT1．5min，PanD1min），30個循環(huán)后72℃延伸10min。AspATPCR產(chǎn)物純化后與質(zhì)粒pRSFDuet－1分別用BamHI和NotI進行雙酶切，所得酶切產(chǎn)物純化后按一定比例在16℃進行過夜連接，隨后轉(zhuǎn)化到E．coli DH5α中，利用卡那霉素抗性篩選得到克隆菌株，提取質(zhì)粒進行酶切驗證和測序，獲得正確的重組子pRSFDuet－1－AspAT。PanDPCR 產(chǎn)物純化后與重組質(zhì)粒pRSFDuet－1－AspAT 分別用NdeI和XhoI進行雙酶切，所得酶切產(chǎn)物純化后按上述方法進行過夜連接，隨后轉(zhuǎn)化到E．coli BL21（DE3）中，利用卡那霉素抗性篩選得到重組表達(dá)菌株，提取質(zhì)粒后經(jīng)雙酶切和測序檢測，獲得重組表達(dá)菌株E．coli BL21（DE3）／pRSFDuet－1－AspAT－PanD。

1．2．2 重組菌發(fā)酵

將重組大腸桿菌E．coli BL21（DE3）／pRSFDuet－1－AspAT－PanD 接種于4mL卡那霉素質(zhì)量濃度為50μg／mL的LB液體培養(yǎng)基，37℃，200r／min振蕩過夜培養(yǎng)。將上述過夜培養(yǎng)物按1%的接種量接種于卡那霉素質(zhì)量濃度為50μg／mL的TB液體培養(yǎng)基，37℃，200r／min振蕩培養(yǎng)菌液至OD600為0．6～0．8，加入IPTG 至終濃度為0．3mmol／L，25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16～20h，培養(yǎng)液于5 000r／min離心15min，收 集 菌 體 細(xì) 胞，用 0．1mol／L 的NaH2PO4／Na2HPO4（pH 7．5）緩沖液清洗菌體一次，通過SDS－PAGE分析鑒定重組蛋白表達(dá)水平。

1．2．3 檢測方法

β－Ala測定：反應(yīng)液用苯基異硫酸酯（PITC）衍生。具體步驟為：取500μL反應(yīng)液于1．5mL離心管中，加入250μL 0．1mol／L PITC乙腈溶液和250μL 1mol／L三乙胺乙腈溶液，充分混勻，避光室溫放置0．5h，加入700μL正己烷溶液，渦旋振蕩器振蕩1min，靜置30～60min，吸取下層溶液，經(jīng)0．22μm有機濾膜過濾，進樣量為10μL。

β－丙氨酸衍生產(chǎn)物用HPLC測定。色譜柱為LaChrom C18（5μm，4．6mm×250mm）；流動相 A溶液為體積分?jǐn)?shù)為80%的已腈水溶液，B溶液為V（乙酸鈉）∶V （乙腈）＝97∶3，pH 6．5的0．1mol／L乙酸鈉－乙腈溶液；采用梯度洗脫，0～20min，B溶液的流速由95%下降到65%；20～30min，B溶液流速由65%上升到95%；30～35min，B溶液梯度不變。檢測波長為254nm，柱溫為40℃。

1．2．4 通透處理

由于表達(dá)的AspAT和PanD都是胞內(nèi)酶，細(xì)胞被膜（細(xì)胞壁和細(xì)胞膜）的屏障作用限制了底物及產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)外的交換，因此菌體的表觀催化活力較差。細(xì)胞透性化技術(shù)可以在不破壞細(xì)胞整體有機體系的情況下改變細(xì)胞被膜的通透性，使得小分子和一些較大分子物質(zhì)能夠自由進出細(xì)胞，使胞內(nèi)酶在相對穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中發(fā)揮作用，從而提高菌體催化效率［15］。

將1．2．2中獲得的菌體按50g／L的質(zhì)量濃度重懸于0．1mol／L的 NaH2PO4／Na2HPO4（pH 7．5）緩沖液中，按5mL／L菌懸液體積分?jǐn)?shù)加入甲苯，于37℃，100r／min轉(zhuǎn)速下振蕩處理1h，離心收集菌體，用0．1mol／L的 NaH2PO4／Na2HPO4（pH 7．5）緩沖液清洗兩次后置于4℃環(huán)境中備用。

1．2．5 酶活檢測

稱取10g富馬酸，加入 適量0．1mol／L 的NaH2PO4／Na2HPO4（pH 7．5）緩沖液攪拌均勻，緩慢加入濃氨水，調(diào)節(jié)pH到7．5后用緩沖液定容至100mL，然后在該體系中加入1．2．4中通透處理過的菌體1g，37℃，200r／min下進行酶促反應(yīng)15min，終止反應(yīng)時取適量反應(yīng)液于100℃煮沸10min，12 000r／min離心10min，取上清，用0．22μm微孔有機濾膜過濾，利用HPLC檢測β－Ala濃度。

酶活定義：在pH 7．5，溫度37℃的條件下，每小時轉(zhuǎn)化生成1μmo／Lβ－Ala的酶量，定義為一個酶活力單位μmol／（g·h），簡稱 U／g。

1．2．6 固定化細(xì)胞制備

向90mL純化水中加入10g經(jīng)通透處理過的菌體和0．6g硅藻土，振蕩均勻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的聚乙烯亞胺溶液3mL，于28℃，100r／min振蕩交聯(lián)1h，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛溶液1mL繼續(xù)振蕩交聯(lián)1h，結(jié)束后抽濾收集固定化細(xì)胞，清水淋洗3次，置于4℃環(huán)境溫度下備用。

1．2．7 固定化細(xì)胞最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

按照1．2．5中酶活測定方法，分別在30，35，40，45，50，55，60，65，70 ℃測定酶活以確定最適反應(yīng)溫度。

將固定化細(xì)胞分別在以上溫度下放置12h，然后在37℃條件下測酶活，比較不同溫度下固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性。

1．2．8 固定化細(xì)胞最適pH以及pH穩(wěn)定性

配制0．1mol／L，pH 為 5．5，6．0，6．5，7．0，7．5，8．0，8．5，9．0，9．5和10的檸檬酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液和Tris－HCl緩沖液，分別用以上不同pH的緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)測定酶活以確定最適pH。

將固定化細(xì)胞分別用以上緩沖液在10℃下保存12h，然后在pH 7．5條件下測酶活，以確定不同pH條件下固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性。

1．2．9 固定化細(xì)胞加酶量及底物質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

設(shè)定富馬酸質(zhì)量濃度100g／L不變，改變固定化細(xì)胞的量，使得富馬酸完全轉(zhuǎn)化為β－Ala，以確定最適的固定化細(xì)胞投加量。

用固定化細(xì)胞分別催化質(zhì)量濃度為100，150，200，250，300，350，400，450g／L的富馬酸轉(zhuǎn)化為β－Ala，HPLC檢測β－Ala含量，以確定最高底物質(zhì)量濃度。

1．2．10 固定化細(xì)胞重復(fù)使用次數(shù)

按照1．2．7～1．2．9中優(yōu)化好的條件，重復(fù)使用固定化細(xì)胞催化富馬酸轉(zhuǎn)化成β－Ala，跟蹤檢測其每次轉(zhuǎn)化最終β－Ala的濃度。

2 結(jié)果與討論

2．1 酶活檢測

在100mL質(zhì)量濃度為100g／L的富馬酸溶液中加入1g通透細(xì)胞，37℃，200r／min下酶促反應(yīng)15min，生成質(zhì)量濃度為19g／L的L－Ala，酶活為85．4U／g。

2．2 固定化細(xì)胞

10g通透細(xì)胞重懸于90mL純水后菌懸液酶活為8．5U／mL，固定化完成后，得固定化細(xì)胞13．4g，酶活為40．9U／g，酶活回收率約64．2%。

2．3 固定化細(xì)胞最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

固定化細(xì)胞的最適反應(yīng)溫度實驗結(jié)果如圖1（a）所示。隨著反應(yīng)溫度的升高，固定化細(xì)胞的酶活呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在50℃條件下酶活最高，45℃條件下與50℃時相差不大。固定化細(xì)胞的熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果如圖1（b）所示，酶的熱穩(wěn)定性在較低的溫度范圍內(nèi)較好，在45℃以下酶活基本無損失，在較高的溫度下酶活損失非常快，55℃下酶活便迅速下降，為30℃酶活的66%。由以上實驗結(jié)果得出：固定化細(xì)胞反應(yīng)最適溫度為50℃，但酶的穩(wěn)定性在45℃以下時保持穩(wěn)定。因此，固定化細(xì)胞在催化富馬酸轉(zhuǎn)化為β－Ala時選擇45℃比較合適，能夠在保證較高酶活的同時保持較高穩(wěn)定性。

圖1 固定化細(xì)胞最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性Fig．1 Optimum reaction temperature and thermal stability of immobilized cells

2．4 固定化細(xì)胞最適pH及pH穩(wěn)定性

固定化細(xì)胞的最適反應(yīng)pH實驗結(jié)果如圖2（a）所示，隨著pH的上升，固定化細(xì)胞的酶活呈現(xiàn)先升后降的趨勢，最適pH為7．5。固定化細(xì)胞在不同pH條件下的穩(wěn)定性如圖2（b）所示，在pH 6．5～8．5的范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。因此，固定化細(xì)胞在催化富馬酸轉(zhuǎn)化為β－Ala時選擇pH 7．5比較合適，能夠在保證較高酶活的同時保持較高穩(wěn)定性。

圖2 固定化細(xì)胞最適pH以及pH穩(wěn)定性Fig．2 Optimum pH and pH stability of immobilized cells

2．5 固定化細(xì)胞投加量及底物質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

在100mL質(zhì)量濃度為100g／L的富馬酸溶液中加入不同量的固定化細(xì)胞，45℃，200r／min下進行酶促反應(yīng)，固定化細(xì)胞的投加量與β－Ala的產(chǎn)率如圖3（a）所示。隨著投酶量的加大，β－Ala的產(chǎn)率也隨之上升，當(dāng)固定化酶加到3g時，β－Ala的產(chǎn)率達(dá)到最大，繼續(xù)增加投酶量，β－Ala的產(chǎn)率不變。因此固定化細(xì)胞的貢獻(xiàn)率為3．3，即1g固定化細(xì)胞可催化3．3g底物。

固定化細(xì)胞催化過程中底物質(zhì)量濃度與β－Ala的產(chǎn)率如圖3（b）所示。底物在質(zhì)量濃度達(dá)到300g／L（包括300g／L）前均可被完全轉(zhuǎn)化成β－Ala，超過300g／L后β－Ala的產(chǎn)率開始下降。隨著底物富馬酸質(zhì)量濃度的增加，產(chǎn)物β－Ala的質(zhì)量濃度也在不斷地增加，當(dāng)β－Ala達(dá)到一定質(zhì)量濃度后會抑制反應(yīng)的進行，使得β－Ala的產(chǎn)率下降，故該固定化細(xì)胞可催化的最高底物質(zhì)量濃度為300g／L。

圖3 固定化細(xì)胞投加量及底物質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig．3 Effect of immobilized cell dosage and substrate concentration on transformation reaction

2．6 固定化細(xì)胞重復(fù)使用次數(shù)

根據(jù)2．3～2．5得出的試驗結(jié)果，在pH 7．5，溫度45℃，200r／min條件下用固定化酶催化質(zhì)量濃度為300g／L的富馬酸轉(zhuǎn)化成β－Ala，每次轉(zhuǎn)化結(jié)束后將固定化細(xì)胞回收洗凈再繼續(xù)轉(zhuǎn)化下一批，測得β－Ala的產(chǎn)率與固定化細(xì)胞使用次數(shù)的關(guān)系如圖4，固定化細(xì)胞可連續(xù)使用12次。

圖4 β－Ala的產(chǎn)率與固定化細(xì)胞得使用次數(shù)的關(guān)系Fig．4 The relationship between the yield ofβ－Ala and the number of times of immobilized cells

3 結(jié) 論

將AspAT和PanD酶構(gòu)建入同一大腸桿菌表達(dá)載體并成功表達(dá)了兩個酶，將菌體做通透處理并固定化，固定化酶活回收率為64．2%，固定化細(xì)胞貢獻(xiàn)率為3．3，在pH 7．5，溫度45℃時最高可將質(zhì)量濃度為300g／L的富馬酸完全轉(zhuǎn)化成β－Ala，固定化細(xì)胞可連續(xù)使用12次。該方法獲得的酶以廉價的富馬酸和氨水為底物，整個反應(yīng)體系中無中間產(chǎn)物L(fēng)－Asp的積累，簡化了生產(chǎn)方法，有效降低了生產(chǎn)成本。