大腸桿菌發(fā)酵中強(qiáng)裂解性噬菌體的分離和鑒定

陳江坡，程江紅，康 培，刁劉洋，3

（1．廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司，河北 廊坊065001；2．梅花生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北 廊坊065001；3．梅花（上海）生物科技有限公司，上海201203）

噬菌體是一類普遍存在于自然界中的感染細(xì)菌并在細(xì)菌內(nèi)完成復(fù)制的病毒，數(shù)量是細(xì)菌的10倍以上［1］。病理學(xué)家Twort和微生物學(xué)家D’Herelle在1915年和1917年分別獨(dú)立發(fā)現(xiàn)了噬菌體［2］。噬菌體由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成，蛋白質(zhì)構(gòu)成的衣殼包裹著核酸，起著保護(hù)核酸的作用，并決定噬菌體的外形和表面特征。噬菌體核酸只有一種類型，即DNA或RNA，雙鏈或單鏈。大部分噬菌體還長(zhǎng)有“尾巴”，用來將遺傳物質(zhì)注入宿主體內(nèi)。根據(jù)噬菌體與宿主的關(guān)系，可將其分為烈性噬菌體與溫和噬菌體。烈性噬菌體通過吸附、侵入、生物合成、裝配與釋放等步驟使宿主細(xì)胞裂解死亡［3］；而溫和噬菌體侵染宿主后并不增殖，其基因整合于細(xì)菌染色體上，即前噬菌體，隨細(xì)菌染色體的復(fù)制而復(fù)制。

在微生物尤其是細(xì)菌發(fā)酵的工業(yè)生產(chǎn)中極易感染噬菌體，目前相關(guān)報(bào)道主要集中在乳制品工業(yè)以及少數(shù)的大宗化學(xué)品產(chǎn)業(yè)，如乳酸、丙酮、丁醇和谷氨酸［4－8］等。感染噬菌體往往導(dǎo)致發(fā)酵過程中菌體大量死亡，輕則使發(fā)酵周期延長(zhǎng)、發(fā)酵產(chǎn)量降低，重則造成倒罐、經(jīng)濟(jì)損失［9］。筆者有目的地從本公司因污染了噬菌體，而導(dǎo)致蘇氨酸發(fā)酵（生產(chǎn)菌為MG1655來源的大腸桿菌）停止的車間培養(yǎng)液中分離噬菌體，最終得到一株裂解能力強(qiáng)大的噬菌體，其對(duì)大腸桿菌MG1655菌株具有高效裂解效果，對(duì)噬菌體進(jìn)行分離、電鏡觀察以及核酸類型鑒定，判斷該噬菌體屬于長(zhǎng)尾病毒科噬菌體。通過分析其生物學(xué)特性，為得到工業(yè)抗噬菌體生產(chǎn)菌奠定基礎(chǔ)，可以避免再次被噬菌體污染，從而降低發(fā)酵成本、節(jié)約能源和人力，保證工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)利益。

1 材料與方法

1．1 材料及菌株

實(shí)驗(yàn)中噬菌體分離所用的樣品來源于本公司蘇氨酸污染噬菌體車間的培養(yǎng)液。大腸桿菌MG1655由本公司實(shí)驗(yàn)室保存。

1．2 培養(yǎng)基、主要試劑和儀器

液體LB培養(yǎng)基：NaCl 10．0g／L，酵母提取物5．0g／L，胰蛋白胨10．0g／L，加蒸餾水定容至1L，121℃，1．15×105Pa滅菌20min。上層LB半固體培養(yǎng)基：在液體LB中加入0．007g／mL瓊脂糖。下層固體LB培養(yǎng)基：在液體LB中加入0．015g／mL瓊脂糖。DNaseI和RNase A購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司（Thermo Fisher Scientific）；離心機(jī)購(gòu)自sigma公司；君意JY04S－3C凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Tecnai Spirit 120kV透射電子顯微鏡為中科院生物物理研究所所有。

1．3 噬菌體的分離與鑒定

將工業(yè)生產(chǎn)菌培養(yǎng)液樣品于LB平板上與MG1655交叉劃線，確定培養(yǎng)液中是否含有噬菌體。樣品4℃，8 000r／min離心10min后使用0．22μm濾膜過濾，利用雙層瓊脂平板法，以大腸桿菌MG1655菌株作為對(duì)照菌，檢測(cè)樣品中是否含有裂解性噬菌體。

1．4 噬菌體的富集及純化

挑取雙層瓊脂平板上單個(gè)噬菌斑進(jìn)行反復(fù)純化，直至獲得形態(tài)和大小一致的噬菌斑。然后不斷富集傳代，增加噬菌體的濃度。

1．5 噬菌體基因組提取方法

噬菌體DNA提取參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

1．6 噬菌體核酸類型鑒定

分別用DNase I，RnaseA，EcoRI和 HindIII處理提取的噬菌體基因組，37℃消化2h，將消化產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳。

1．7 噬菌體電鏡觀察

噬菌體富集傳代后，采用磷鎢酸負(fù)染法，通過透射電子顯微鏡觀察噬菌體形態(tài)特征。

2 結(jié)果與分析

2．1 噬菌體的驗(yàn)證

將工業(yè)生產(chǎn)菌培養(yǎng)液樣品于LB平板上與MG1655交叉劃線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中確實(shí)含有能夠侵染MG1655的噬菌體，如圖1所示。

圖1 噬菌體MHV4存在的驗(yàn)證Fig．1 The presence of phage MHV4

2．2 噬菌體的分離及噬菌斑特征

工業(yè)生產(chǎn)菌培養(yǎng)液樣品過濾上清后與大腸桿菌MG1655混合，37℃培養(yǎng)10min。經(jīng)過雙層瓊脂平板法分離和純化，37℃培養(yǎng)12h后，在平板上能形成明顯噬菌斑。噬菌斑呈圓形、大而透明且邊緣整齊，呈現(xiàn)出裂解性噬菌體的噬菌斑特征（圖2）。

圖2 噬菌體MHV4噬菌斑形態(tài)特征Fig．2 Morphological feature of phage MHV4plaques

2．3 噬菌體核酸類型鑒定

噬菌體 MHV4的基因組分別經(jīng) DNase I，RNase A，EcoRI和HindIII處理后進(jìn)行核酸電泳。電泳結(jié)果顯示噬菌體MHV4的基因組能被Dnase I完全降解，但經(jīng)RNase A處理后無明顯變化，表明其基因組核酸為DNA。由于噬菌體MHV4的基因組能夠被EcoRI和HindIII酶切，表明該噬菌體基因組為雙鏈DNA，其基因組大小為43kb左右（圖3）。

圖3 噬菌體MHV4核酸類型鑒定Fig．3 Nucleic acid type of phage MHV4

2．4 噬菌體的電鏡觀察

純化和富集的噬菌體經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后，在透射電子顯微鏡下觀察到的形態(tài)如圖4所示。噬菌體MHV4的頭部呈二十面體立體對(duì)稱，頭部直徑約70nm，噬菌體含非收縮性尾部，寬約10nm，長(zhǎng)約160nm。根據(jù)2012年國(guó)際病毒分類委員會(huì)第9次報(bào)告提出的噬菌體分類與命名標(biāo)準(zhǔn)，該噬菌體符合長(zhǎng)尾噬菌體科（Siphoviridae）特征。

圖4 噬菌體MHV4電鏡照片F(xiàn)ig．4 Electron micrograph of phage MHV4

3 結(jié) 論

在自然界中，噬菌體與宿主總是共同存在和進(jìn)化的，兩者之間存在著復(fù)雜的抗性和逃逸機(jī)制［10－11］。噬菌體感染是以細(xì)菌為基礎(chǔ)的生物技術(shù)發(fā)展過程中的一個(gè)棘手的問題。深入理解噬菌體與宿主之間的相互作用是解決這一問題的關(guān)鍵。目前工業(yè)發(fā)酵中對(duì)噬菌體感染防治主要有以下策略：1）感染源的控制（對(duì)取樣發(fā)酵液和分析后的發(fā)酵液都要滅菌處理后再排放，要注意空氣系統(tǒng)的滅菌處理，尾氣或逃液均要滅菌后才能排放，注意保持環(huán)境衛(wèi)生）；2）輪換菌株（菌株輪換是工業(yè)中常用的方法，即選用另一抗噬菌體菌株進(jìn)行生產(chǎn)或更換菌種轉(zhuǎn)產(chǎn)其他產(chǎn)品，避免該噬菌體的連續(xù)污染）；3）傳統(tǒng)的基因工程（使用傳統(tǒng)的基因工程方法阻止噬菌體感染生產(chǎn)菌的各個(gè)階段）；4）基于CRISPR－Cas系統(tǒng)的噬菌體防治（使用CRISPR－Cas系統(tǒng)進(jìn)行核酸修飾從而對(duì)抗外來遺傳物質(zhì)的入侵［12］）。因?yàn)槲⑸锇l(fā)酵法具有生產(chǎn)工藝相對(duì)簡(jiǎn)單［13］、材料來源廣泛、高效性、低成本［14］和低污染等優(yōu)勢(shì)而得到大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用［15］。因?yàn)楝F(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵都傾向于大容積發(fā)酵罐并利用連續(xù)發(fā)酵工藝，所以一旦感染噬菌體將會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵停止、菌體消失、發(fā)酵產(chǎn)物不會(huì)繼續(xù)積累和發(fā)酵水平嚴(yán)重下降，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究采用雙層瓊脂平板法從本公司感染了噬菌體的蘇氨酸生車間培養(yǎng)液分離、純化獲得一株能高效裂解大腸桿菌MG1655的噬菌體。其噬菌斑呈圓形、大而透明、邊緣整齊。電鏡觀察頭部呈二十面體立體對(duì)稱，尾部較長(zhǎng)。酶切結(jié)果表明核酸類型為dsDNA，所以確定其屬于有尾噬菌體目長(zhǎng)尾噬菌體科成員，命名為MHV4。接下來可以通過自發(fā)突變、紫外誘變以及CRISPR－Cas等方法進(jìn)行抗噬菌體工程菌的篩選，預(yù)期得到生產(chǎn)性能不下降的抗噬菌體MHV4的生產(chǎn)菌株。