兩株新的金黃色葡萄球菌烈性噬菌體的生物學特性和基因組學研究

靳曉東，張聰慧，鐘江

復旦大學生命科學學院微生物學與微生物工程系, 上海 200438

奶牛乳腺炎是奶牛中常見的乳腺炎癥反應，嚴重影響牛奶的質量和產(chǎn)量。其主要致病菌是金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)等[1]。金黃色葡萄球菌是隱性奶牛乳腺炎的主要致病菌[2]。目前，抗生素是治療奶牛乳腺炎的主要手段[3]，但抗生素長期使用往往引起細菌耐藥性，導致治療效果不佳[4]，且牛奶因抗生素殘留而被廢棄，嚴重影響牛奶產(chǎn)業(yè)[5]。

噬菌體用于抗菌治療具有特異性強、成本低等優(yōu)點，且不會產(chǎn)生耐藥性等不良反應，逐漸引起國內外研究者的重視[6]。已有一些研究成功利用金黃色葡萄球菌噬菌體進行了奶牛乳腺炎治療[7-8]，為奶牛乳腺炎的噬菌體療法提供了理論基礎。

噬菌體具有宿主特異性，獲得更多種類的噬菌體，建立噬菌體庫，對更好地應用噬菌體療法具有重要意義。本研究從奶牛場廢水中分離到兩株金黃色葡萄球菌烈性噬菌體，對其生物學和基因組學特征進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

金黃色葡萄球菌標準株ATCC 25923、1株牛源金黃色葡萄球菌cowSA_1、1株人源金黃色葡萄球菌humanSA_1及1株人源表皮葡萄球菌(S.epidermidis)humanSE_1為本實驗室保藏。細菌培養(yǎng)采用高鹽LB培養(yǎng)基(酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉70 g/L，pH 7.0，分別添加 0.7% 瓊脂糖和 1.8% 瓊脂獲得半固體和固體高鹽LB培養(yǎng)基)。

1.2 方法

1.2.1噬菌體的分離和純化取自上海市寶山區(qū)某奶牛場，樣品為患病奶牛乳房清洗液，4 ℃ 2 000g離心10 min后取上清液，以ATCC 25923作為指示菌，用雙層瓊脂平板法檢測是否含有裂解性噬菌體。挑取單個噬斑，進行反復噬斑純化，直至獲得形態(tài)和大小一致的噬斑。

1.2.2噬菌體的電子顯微鏡觀察采用磷鎢酸負染法。取15 mL擴增純化的噬菌體裂解液，超濾管濃縮為1 mL，取100 μL濃縮液滴于干凈的銅網(wǎng)上，待其沉降10 min，用2%磷鎢酸(pH 6.8)染色10 min，濾紙吸去殘余液體，透射電子顯微鏡(型號：JEM-2100)觀察噬菌體形態(tài)。

1.2.3噬菌體的熱穩(wěn)定性噬菌體用無菌SM緩沖液(5.8 g NaCl、2 g MgSO4·7H2O、50 mL 1 mol/L Tris-HCl pH 7.5、5 mL 2%明膠、1 L H2O)稀釋，以合適比例與ATCC 25923菌液混合，分別置于4 ℃、37 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃水浴孵育1 h后，測定噬菌體的滴度。

1.2.4噬菌體的酸堿穩(wěn)定性噬菌體用SM緩沖液適當稀釋后，加至pH為 1.0～10.0 的TM緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl pH 7.2～7.5、10 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、5 mmol/L CaCl2，加濃鹽酸或5 mol/L NaOH調節(jié)成不同pH的緩沖液，加H2O定容至100 mL)，以及pH為 11.0、12.0 的NaH2PO4-NaOH緩沖液(50 mL 0.05 mol/L NaH2PO4、26.9 mL 0.1 mol/L NaOH，用5 mol/L NaOH調節(jié)成不同pH的緩沖液，加H2O定容至100 mL)中，37 ℃水浴孵育1 h后，測定噬菌體滴度。

1.2.5噬菌體的一步生長曲線經(jīng)測定，OD600=0.5 時，菌液密度為 2.26×108CFU/mL，以此計算噬菌體感染的感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)。培養(yǎng)ATCC 25923至對數(shù)生長期OD600=0.5，以MOI=0.01 PFU/CFU加入噬菌體液，37 ℃ 孵育10 min，13 000g離心10 min，棄上清液，沉淀重懸于5 mL培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔10 min取樣，分別測定噬菌體滴度。

1.2.6噬菌體抑菌能力測定將對數(shù)生長期的ATCC 25923以MOI為0、0.01、0.1、1 PFU/CFU的比例加入噬菌體液，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔 30 min 取出100 μL混合液測OD600值。

1.2.7噬菌體基因組測序及分析噬菌體基因組抽提采用λ噬菌體DNA快速抽提試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)，按說明書操作；全基因組序列分析由美吉生物有限公司利用Illumina PE測序平臺進行；全基因組序列功能注釋采用RAST(http://rast.nmpdr.org/)在線軟件[9-11]；用MAGE5構建系統(tǒng)進化樹[12]。

2 結果

2.1 噬菌體的分離和電子顯微鏡觀察

以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為宿主菌，從奶牛場分離得到兩株金黃色葡萄球菌烈性噬菌體。經(jīng)過3次純化后，在雙層瓊脂平板上形成清晰、透亮的噬斑，直徑 0.5～1.0 mm，分別命名為phiSA_BS1和phiSA_BS2。噬菌體經(jīng)磷鎢酸負染后，透射電子顯微鏡觀察結果顯示，兩株噬菌體均由一個多面體對稱的頭部和可伸縮尾部組成(圖1)。phiSA_BS1頭部長(86.1±3.9) nm，寬(74.7±3.9) nm；尾長(214.1±16.5) nm，寬(21.9±5.5) nm。phiSA_BS2頭部長(85.9±5.3) nm，寬(74.0±7.3) nm；尾長(222.2±8.6) nm，寬(18.2±1.9) nm。從形態(tài)上初步判斷兩株噬菌體均屬于肌尾噬菌體科[13]。

2.2 噬菌體的生物學性狀

2.2.1一步生長曲線將噬菌體與金黃色葡萄球菌ATCC 25923以MOI=0.01 混合，振蕩培養(yǎng)，每隔10 min取樣并測定噬菌體滴度。結果如圖2A所示，phiSA_BS1的潛伏期約為20 min，裂解期約為20 min，溶菌周期為20～40 min，裂解量約為127 PFU/cell。phiSA_BS2的潛伏期約為20 min，裂解期比phiSA_BS1略長，約為30 min，溶菌周期為 20～50 min，裂解量約為139 PFU/cell。

2.2.2酸堿穩(wěn)定性將phiSA_BS1、phiSA_BS2適當稀釋后加至不同pH的緩沖液中，37 ℃水浴孵育1 h后測定滴度。結果如圖2B所示，phiSA_BS1的pH耐受范圍為 5.0～10.0， phiSA_BS2的pH耐受范圍為 3.0～10.0。當pH>11或pH<2時，兩株噬菌體幾乎全部失活。總體來看，兩株噬菌體具有較寬的酸堿耐受性，phiSA_BS2的耐酸性更強。

2.2.3熱穩(wěn)定性將噬菌體分別在不同溫度下孵育1 h后，測定滴度。結果如圖2C所示，50 ℃仍保留相當高的滴度，但>60 ℃時兩株噬菌體幾乎全部失活。

2.2.4抑菌能力將對數(shù)期ATCC 25923以不同MOI加入噬菌體液，振蕩培養(yǎng)，每隔30～60 min取100 μL混合液測OD600值。結果如圖3所示，相比于對照組，兩株噬菌體均有效抑制了宿主菌的增殖。phiSA_BS1在MOI=1、0.1、0.01 時能有效抑制宿主菌增殖。phiSA_BS2在MOI=1和 0.1 時也可有效抑制宿主菌增殖，但所需時間更長，裂解效率略低于phiSA_BS1。

A: phiSA_BS1. B: phiSA_BS2.

圖1兩株金黃色葡萄球菌噬菌體的電子顯微鏡觀察

Fig.1ElectronmicroscopyoftwoisolatesofStaphylococcusaureusphages

A: One-step growth curve. B: pH tolerance. C. Temperature tolerance.

圖2兩株噬菌體的生物學性狀

Fig.2BiologicalpropertiesofphiSA_BS1andphiSA_BS2

A: phiSA_BS1. B: phiSA_BS2.

圖3兩株噬菌體的抑菌能力

Fig.3InhibitionofS.aureusbyphiSA_BS1andphiSA_BS2

2.3 噬菌體的宿主譜分析

取等量phiSA_BS1與phiSA_BS2，分別感染一定數(shù)量的ATCC 25923，牛源和人源金黃色葡萄球菌分離株cowSA_1、humanSA_1，表皮葡萄球菌分離株humanSE_1，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察噬菌斑的數(shù)量及大小。結果如表1所示， 兩株噬菌體對3株金黃色葡萄球菌均有裂解作用，但對表皮葡萄球菌沒有裂解作用。比較噬菌斑數(shù)量和大小，以ATCC 25923最多，噬菌斑也最大，為 0.5～1 mm；其次為cowSA_1，噬菌斑大小為 0.3～0.5 mm；humanSA_1的噬菌斑最小，為 0.2～0.3 mm。兩株噬菌體對這3株金黃色葡萄球菌的裂解能力大小為：ATCC 25923>cowSA_1>humanSA_1。

表1兩株噬菌體感染4株葡萄球菌的比較

Tab.1ComparisonoftheinfectionoffourstrainsofStaphylococcusbyphiSA_BS1andphiSA_BS2

PhageATCC 25923cowSA_1humanSA_1humanSE_1phiSA_BS1phiSA_BS2Titer (×108 PFU/mL)10.0±4.8 8.35±0.373.25±0.020Size of plaques++++++-Titer (×108 PFU/mL)2.96±0.054.16±0.151.26±0.060Size of plaques++++++-

+++: large size plaques; ++: median size plaques; +: small size plaques; -: no plaques.

2.4 噬菌體全基因組序列測定和系統(tǒng)進化分析

采用二代測序技術完成兩株噬菌體的測序?；蚪M核酸序列及注釋結果已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號MH078572、MH028956)。序列特征如表2所示，兩者基因組大小分別為 142.9 kb和 149.2 kb。與phiSA_BS1相比，phiSA_BS2基因組全長多出7 kb左右，GC含量略低于前者，多出9個開放讀碼框(open reading frame，ORF)。

將phiSA_BS1、phiSA_BS2的全基因組核酸序列及主要尾部蛋白(major tail protein)、噬菌體裂解酶(endolysin)等蛋白序列與美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫比對，應用MEGA軟件進行進化樹分析，結果如圖4～6所示。

表2兩株噬菌體的基因組特征

Tab.2GenomiccharacteristicsofphiSA_BS1andphiSA_BS2

GenomephiSA_BS1phiSA_BS2Type of nucleic acidLinear, double- stranded DNALinear, double- stranded DNALength142 978 bp149 230 bpGC content29.80%29.61%Predicted ORFs201210 Structure and proteins84 Porin11 Lysin12 Hypothetic proteins164169 DNA replication and modification 2420 Transcription regulation21 tRNA01 Other112

圖4噬菌體全基因組核酸序列進化樹分析

Fig.4Phylogenicanalysisoffullgenomeofphages

圖5噬菌體主要尾部蛋白的進化樹分析

Fig.5Phylogenicanalysisofmajortailproteinsofphages

圖6噬菌體裂解酶進化樹分析

Fig.6Phylogenicanalysisoflysinsofphages

全基因組分析結果表明，phiSA_BS1與phiSA_BS2的同源性高達99%，但兩者與已報道的金黃色葡萄球菌噬菌體親緣關系較遠(圖4)，判斷兩株噬菌體構成金黃色葡萄球菌噬菌體的新進化分支。對主要尾部蛋白的分析也證實了這一點(圖5)。

3 討論

本研究分離到兩株金黃色葡萄球菌裂解性噬菌體phiSA_BS1和phiSA_BS2，并對形態(tài)、復制特征、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及其對不同葡萄球菌分離株的裂解性進行了初步研究。結果表明，這兩株噬菌體能耐受50 ℃處理，pH耐受范圍也較寬?？紤]到生物安全性，對這兩株噬菌體在乳酸菌、腸桿菌、腸球菌中進行了裂解實驗，結果均為陰性(數(shù)據(jù)未在本文顯示)。

對兩株噬菌體進行全基因組測序，結果表明，兩株噬菌體的親緣關系非常接近，同源性高達99%，但均與已知的金黃色葡萄球菌噬菌體親緣關系較遠。與最近緣的噬菌體676Z進行NCBI blastn全基因組比較，發(fā)現(xiàn)phiSA_BS1與其覆蓋度(query cover)為42%，相似度(ident)為75%；phiSA_BS2與其覆蓋度為41%，相似度為75%。由此可判斷兩株噬菌體均為全新的金黃色葡萄球菌噬菌體進化分支。對噬菌體功能基因的系統(tǒng)發(fā)育分析也證實了這一點。

噬菌體裂解酶因具有直接的殺菌作用而受到關注。將兩株噬菌體的裂解酶氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對分析發(fā)現(xiàn)，同源性較高的序列均為金黃色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、小牛葡萄球菌(S.vitulinus)等中含CHAP結構域的蛋白(CHAP domain-containing protein)，與其他噬菌體的裂解酶顯著不同，具有一定的研究價值。

奶牛乳腺炎是乳業(yè)的重要挑戰(zhàn)之一。一方面細菌耐藥性的日益增長使其治療越來越困難，另一方面即使可用抗生素進行治療，但用藥后相當長時間內所產(chǎn)的牛奶會因為抗生素污染而被廢棄。因此，研發(fā)替代抗生素的療法很有意義，噬菌體療法就是潛在的替代療法之一。體外實驗中，已有相關研究證實金黃色葡萄球菌噬菌體可有效抑制宿主菌增殖[14-16]。體內實驗中，奶牛乳腺炎的噬菌體療法也取得了一定進展。例如，孫利利等[8]將噬菌體通過乳頭管灌注患病乳室，對急性乳腺炎奶牛進行治療，發(fā)現(xiàn)噬菌體具有明顯療效。近年來，對致病性金黃色葡萄球菌噬菌體的分離越來越多，生物學性狀也獲得了鑒定。隨著高通量測序的發(fā)展，噬菌體全基因組序列特征得到了解析，完善了噬菌體庫，為奶牛乳腺炎的噬菌體療法提供了基礎數(shù)據(jù)[17-21]。本研究從奶牛場分離到的兩株噬菌體均為裂解性噬菌體，生物學性狀穩(wěn)定，在奶牛乳腺炎的治療中具有潛在應用價值。