柯薩奇病毒 A16型抗原與呼吸道黏膜上皮組織內(nèi)先天淋巴細(xì)胞的相互關(guān)系及其疫苗應(yīng)用價(jià)值

王永蓉，廉亞茹,，蔣國潤，范勝濤，馮敏，楊二霞，姜莉，董承紅，趙志梅，王麗春，廖蕓，張瑩，李琦涵

1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118； 2. 艾美康淮生物制藥(江蘇)有限公司，泰州 225300

柯薩奇病毒A16型(coxsakievirus A16，CA16)作為腸道病毒家族成員之一[1]，與腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)類似，是引起兒童手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)的主要病原體[2-3]，這兩種病毒引起的HFMD病例達(dá)總病例的80%[4-5]。雖然EV71滅活疫苗已大規(guī)模推廣應(yīng)用[6]，但其對(duì)CA16無交叉保護(hù)作用，因此CA16很可能成為今后兒童HFMD的主要病原[7]，針對(duì)CA16的疫苗研究具有十分重要的意義[8]。

近年來，隨著相關(guān)研究工作的推進(jìn)，CA16疫苗研究已在多種技術(shù)層面取得進(jìn)步[9-10]，但CA16感染病理學(xué)及相關(guān)免疫學(xué)基礎(chǔ)尚不清楚，迄今尚未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。本課題組前期有關(guān)CA16滅活疫苗的非人靈長類實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CA16滅活疫苗以常規(guī)模式難以獲得良好的有效免疫反應(yīng)，尤其是在病毒攻擊時(shí)未能表現(xiàn)出有效的臨床保護(hù)效果[11]。盡管這一動(dòng)物模型結(jié)果尚不能完全模擬CA16在人體內(nèi)的感染與免疫過程，但深入探討其免疫學(xué)機(jī)制十分必要。

大量人群流行病學(xué)和臨床觀察及本課題組前期動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CA16和EV71均可通過呼吸系統(tǒng)導(dǎo)致感染[12-14]。呼吸道上皮組織作為具有天然免疫功能的器官，在機(jī)體抗病毒感染免疫反應(yīng)的激活中發(fā)揮著重要作用[15-16]。近期受到人們關(guān)注的天然淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cell，ILC)則是完成這一作用的主要成分之一[17]。ILC分為3個(gè)型別：ILC1、ILC及 ILC3。它們可由多種信號(hào)通路分子活化，包括表達(dá)于上皮細(xì)胞表面的干擾素(interferon，IFN)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)家族信號(hào)通路分子。受到病毒刺激時(shí)，ILC表面與這些信號(hào)分子結(jié)合的受體表達(dá)量會(huì)增加，以調(diào)節(jié)或整合天然免疫與適應(yīng)性免疫，甚至非特異炎癥效應(yīng)[18-19]。盡管ILC在機(jī)體抵抗病原體入侵免疫應(yīng)答中的作用尚未完全清楚，但I(xiàn)LC缺失小鼠在病原體感染時(shí)不能提供有效的免疫保護(hù)，表明其在機(jī)體抵抗病原體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20-22]。

本研究利用組織培養(yǎng)體系和BALB/c小鼠模型，初步分析CA16抗原與ILC的相互關(guān)系及由此形成的機(jī)體特異性免疫反應(yīng)的特點(diǎn)，為進(jìn)一步探索基于病毒感染模型而設(shè)計(jì)相應(yīng)疫苗免疫模式的可能提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1毒株及細(xì)胞CA16-G20株病毒從中國廣西壯族自治區(qū)全州縣的HFMD患兒咽拭子中分離，并經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所培養(yǎng)、純化及保存[11]。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)標(biāo)記的CA16(EGFP-CA16)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。小鼠氣管上皮細(xì)胞CP-M175購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2主要試劑及設(shè)備TriZol試劑、DAB試劑購自天根生化科技(北京)有限公司，One-Step PrimeScript RT-PCR Kit購自日本TaKaRa公司，CA16抗體、細(xì)胞特異性表面標(biāo)記KLRG1和CD11c、白細(xì)胞介素13(interleukin 13，IL-13)、TNF-α、IFN-γ、特異性熒光二抗等購自英國Abcam公司，GATA-3購自美國Santa Cruz公司，NKP46購自BioLegend 公司，視黃酸相關(guān)孤兒受體γt(retinoid-related orphan receptor γt，RORγt)、 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自美國BD公司，Areg、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β, IL-1β)購自美國R&D Systems公司，IL-22購自美國Novus公司，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、蘇木素購自美國Sigma公司，淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司，小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)試劑盒購自美國Mabtech公司。實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器為實(shí)時(shí)定量PCR儀(CFX ConnectTMReal-Time PCR Detection System；Bio-Rad，美國)、冷凍切片機(jī)(Thermo，美國)、TCS SP8熒光共聚焦顯微鏡(Leica，德國)和C.T.L酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)讀板機(jī)(Cellular Technology Limited，美國)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用BALB/c小鼠購于北京維通利華生物公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過，飼養(yǎng)管理等均符合動(dòng)物福利要求。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)Vero細(xì)胞由含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，16HBE細(xì)胞由含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，CP-M175細(xì)胞培養(yǎng)在特別配制的完全培養(yǎng)基(CM-M175)中。

1.2.2CA16滅活抗原的制備與疫苗配方抗原滅活、純化方法如文獻(xiàn)所述[23]，然后按兩種方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)用疫苗的制備：①病毒抗原(400 EU/1.0 mL)與Al(OH)3佐劑(1 mg/mL)混合制備；②病毒抗原(400 EU/1.0 mL)與一種緩沖液(含1%角鯊烯、3%丙三醇和5%蔗糖)混合配制。

1.2.3病毒純化采用噬斑純化法對(duì)病毒進(jìn)行純化。將病毒樣本連續(xù)10倍稀釋，取不同稀釋度的病毒液接種于細(xì)胞，于37 ℃孵育1 h，移去上清液，每孔加入含1×DMEM、3% FBS及1%瓊脂的混合試劑，于37 ℃孵育7 d，以多聚甲醛固定，0.1% 結(jié)晶紫染色[24]。

1.2.4定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(quantitativereversetranscription-polymerasechainreaction，qRT-PCR) 利用TriZol試劑對(duì)樣品RNA進(jìn)行抽提。qRT-PCR按One-Step PrimeScript RT-PCR 試劑盒說明操作，特異性引物序列詳見表1。在CFX ConnectTMReal-Time PCR Detection System儀上進(jìn)行擴(kuò)增，條件為42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，Tm 30 s，40個(gè)循環(huán)。以相對(duì)定量法計(jì)算各信號(hào)分子的表達(dá)量，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1PCR引物序列

Tab.1SequencesofprimersforPCR

GeneSequence (5' to 3')H-4-1BBL-FACTCCTGGACTTAGACGATH-4-1BBL-RGCTGGCACATTACAGATGH-BTLA-FCAAGTTGGAAGGAAGAGAAGAH-BTLA-RGCAGAACAGCGGTATGACH-CD160-FGGATAGATGGTGTTGGTGAAH-CD160-RCCTGACTTCTGGCTTCTGH-GITRL-FCAATTAGAGACTGCTAAGGAGH-GITRL-RAGGTTCAGAAGATGCCATTH-IKKα-FATACAGCGAGCAGATGACH-IKKα-RCAACCTCAGCATAGTGGATH-IKKβ-FCATTGTTGTTAGCGAAGACTH-IKKβ-RGCCAGGACACTGTTAAGATH-LIGHT-FTCTTGCTGTTGTTCATTGCH-LIGHT-RCCTTCTTGGATGCTTCATTCH-LTα3-FGATGTCTGTCTGGCTGAGH-LTα3-RCCTGCTCTTCCTCTGTGTH-NIK-FCCGAGAAGAAGTCCACTGH-NIK-RGTCTGCTTGTCCTCCATCH-OX40L-FATGAGTCAAGGAGTGTAACCH-OX40L-RATGGCTGAGGAAGATGTAAGH-RANKL-FGGAGGAAGCACCAAGTATTH-RANKL-RCCTCTCCAGACCGTAACTH-TAK-FCCAACCAGAGTCGCAATCH-TAK-RGCAAGTCACATAGCAGAAGAH-TLIA-FAAGCCAGACTCCATCACTH-TLIA-RTACCTACTTCGCATACAGAC

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

1.2.5小鼠實(shí)驗(yàn)分組及免疫體外實(shí)驗(yàn)：鼻腔途徑免疫4周齡小鼠(100 EU/只)。免疫后第1、2、3天分別處死小鼠，采集口、鼻、肺組織，進(jìn)行RNA提取和組織切片，用于qRT-PCR、免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：將4周齡小鼠分為A、B、C、D四個(gè)組，進(jìn)行兩次免疫(每次100 EU/只)，間隔28 d。A組兩次免疫均采用肌內(nèi)注射；B組初次免疫采用肌內(nèi)注射，加強(qiáng)免疫采用鼻腔途徑；C組采用鼻腔途徑僅進(jìn)行一次免疫；D組兩次免疫均采用鼻腔途徑。于免疫前，一次免疫后14、28 d，二次免疫后7、14、28 d分別采血，分離血清，進(jìn)行中和抗體測定。另外，于初次免疫后第28天和加強(qiáng)免疫后第1、3、5天分別處死小鼠，取脾臟，分離淋巴細(xì)胞，進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)。于全程免疫后第56天，對(duì)免疫組的雌鼠與非免疫組的正常雄鼠交配產(chǎn)下的乳鼠(24 h內(nèi))以顱內(nèi)注射CA16(2×104CCID50/只)方式攻擊，每日觀察乳鼠活動(dòng)、進(jìn)食情況及生存率。

(1)為保持開挖后基巖的完整性和開挖面的平整度，對(duì)巖質(zhì)基礎(chǔ)、邊坡、馬道的所有輪廓線上的垂直、斜坡面必須采用控制爆破。

1.2.6共聚焦顯微鏡檢測利用冷凍切片機(jī)將保存于液氮中的組織樣品切成薄片，丙酮固定，然后進(jìn)行抗原封閉(5% BSA溶液)，孵育特異性一抗，清洗，再孵育熒光標(biāo)記的二抗，清洗，滴加DAPI，用熒光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7免疫組織化學(xué)檢測組織切片用丙酮固定，置于3% H2O2中去除內(nèi)源性過氧化物酶，然后以5% BSA封閉，隨后分別孵育特異性一抗和相應(yīng)二抗，清洗，滴加DAB，以蘇木素復(fù)染，置于顯微鏡下觀察。

1.2.8中和抗體檢測按標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方案倍比稀釋血清樣本，用于中和抗體檢測[23]。將不同稀釋度的血清與病毒液(每孔300 CCID50/100 μL)于37 ℃孵育1 h，加入Vero細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)7 d，每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)。

1.2.9ELISPOT實(shí)驗(yàn)采用淋巴細(xì)胞分離液，從小鼠脾臟中分離淋巴細(xì)胞。按IFN-γ ELISPOT試劑盒說明書操作，加入純化的CA16滅活抗原(20 EU/孔)刺激，利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)讀板機(jī)檢測分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)比較基因相對(duì)表達(dá)量，生存率采用log-rank法分析，P<0.05 為差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 CA16感染16HBE后上調(diào)ILC激活相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)

本課題組前期研究證實(shí)，CA16可感染包括呼吸道上皮細(xì)胞在內(nèi)的人類多種細(xì)胞[25-26]。本研究用CA16感染體外培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞16HBE，感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為 0.1～0.2 時(shí)，CA16可引起16HBE細(xì)胞發(fā)生病變(圖1A)，伴隨細(xì)胞逐漸腫脹變圓及從培養(yǎng)瓶底部脫落這一過程的是病毒動(dòng)力學(xué)增殖過程(圖1B)。呼吸道上皮細(xì)胞表面表達(dá)多種受體，如模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)、病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)和能激活免疫細(xì)胞的信號(hào)分子[27-28]。通過這些受體行使功能，呼吸道上皮細(xì)胞在天然免疫中發(fā)揮著十分重要的作用。用CA16(MOI=1)感染人支氣管上皮細(xì)胞后，檢測上皮細(xì)胞表達(dá)的ILC激活相關(guān)重要信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄水平，包括IFN和TNF家族。結(jié)果顯示，在CA16感染早期，16HBE細(xì)胞就上調(diào)了針對(duì)ILC活化的信號(hào)分子表達(dá)，包括TNF-α、RANKL、GITRL、LIGHT。相較之下，IFN-α上調(diào)程度較低，而IFN-λ表達(dá)水平明顯上升(圖1C)。結(jié)果提示， CA16感染氣管內(nèi)具有重要天然免疫啟動(dòng)作用的上皮細(xì)胞的過程實(shí)際上是一個(gè)上調(diào)組織內(nèi)激活天然免疫系統(tǒng)信號(hào)分子的階段。

A: Typical cytopathic effects of 16HBE cells during CA16 infection. The sample was obtained at 8, 16, 24, 32 and 48 h after CA16 infection. B: Viral dynamic proliferation in 16HBE cells. C: Expression of signaling molecules that activate ILCs in CA16-infected 16HBE cells. The sample was obtained at 8, 16 and 24 h after CA16 infection. The results were normalized to the level of endogenous GAPDH. The y-axis indicates the relative quantity of specific mRNA in the samples compared with the same gene in the control group (uninfected cells, y=1). Error bars indicate the SEM of the relative quantities.*P<0.05.

圖1CA16感染人氣管上皮細(xì)胞16HBE的生物學(xué)特性

Fig.1BiologicalanalysisofCA16infectioninhumantrachealepithelial16HBEcells

2.2 CA16抗原導(dǎo)入CP-M175后上調(diào)ILC激活相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)

進(jìn)一步探討CA16抗原或滅活的CA16是否也能模擬活病毒對(duì)ILC的激活起刺激作用，從而為后續(xù)能在動(dòng)物模型中揭示其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。然而，成年小鼠體內(nèi)缺乏CA16受體而對(duì)CA16不易感，因此采用特別配制的類脂性試劑與CA16滅活病毒制備實(shí)驗(yàn)用疫苗，研究CA16抗原與小鼠氣管上皮細(xì)胞系CP-M175的相互作用。

A: Transduction efficiency of CA16 antigen in CP-M175 cells. The fluorescence intensity was scanned by gray-scale software. The sample was obtained at 8, 16 and 24 h after CA16 infection. B: Expression of signaling molecules that activate ILCs in CA16-infected CP-M175 cells. The sample was obtained at 8, 16 and 24 h after CA16 infection. The results were normalized to the level of endogenous GAPDH. The y-axis indicates the relative quantity of the specific mRNA in the samples compared with the same gene in the control group [cells treated with specific buffer (containing 1% squalene, 3% glycerol, 5% sucrose) but without viral antigen, y=1]. Error bars indicate the SEM of the relative quantities.*P<0.05.

圖2滅活的CA16顆粒內(nèi)化到小鼠呼吸道CP-M175細(xì)胞中上調(diào)ILC激活相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)

Fig.2InactivatedCA16virusparticlesinternalizedintomouseepithelialCP-M175cellsupregulatesignalingmoleculesforILCactivation

2.3 CA16抗原在呼吸道上皮組織中的分布及相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)

上皮細(xì)胞可通過分泌功能分子與免疫細(xì)胞相互作用來調(diào)節(jié)天然免疫和適應(yīng)性免疫[29]。為進(jìn)一步研究CA16抗原與ILC的相互作用，采用特別配制的CA16滅活實(shí)驗(yàn)疫苗通過鼻腔途徑免疫BALB/c小鼠，以模擬病毒在自然情況下的感染。于免疫后第1、2、3天，分別處死小鼠，檢測呼吸道組織包括鼻腔、口腔和肺組織病毒抗原分布及對(duì)ILC有激活作用的信號(hào)通路分子的表達(dá)量。結(jié)果顯示，抗原經(jīng)鼻腔免疫后3 d內(nèi)，呼吸道黏膜組織中可觀察到CA16抗原廣泛分布(圖3A)。此外，對(duì)ILC有激活作用的多種信號(hào)通路分子mRNA均出現(xiàn)明顯上調(diào)，包括TNF-α、RANKL、CD160、LIGHT及GITRL(圖3B)。這與CA16感染人上皮細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)的ILC激活相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)趨勢類似。這些基因高表達(dá)區(qū)域主要集中于上呼吸道，特別是口腔和鼻腔組織；而肺組織中只有TNF-α出現(xiàn)較高表達(dá)(圖3B)。此外，還檢測了各類ILC活化后分泌的細(xì)胞因子表達(dá)水平(圖3C)?？谇缓捅乔唤M織中ILC分泌的各種細(xì)胞因子基因表達(dá)趨勢類似，但鼻腔組織中的表達(dá)水平高于口腔；肺組織中僅IL-22、IL-25、IL-1β及Areg表達(dá)升高。結(jié)果表明，CA16抗原內(nèi)化到呼吸道黏膜上皮細(xì)胞后，能被上皮細(xì)胞表面的PRR識(shí)別并上調(diào)ILC激活相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)，同時(shí)ILC分泌的各類細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量明顯升高。

2.4 CA16抗原進(jìn)入呼吸道黏膜組織后與ILC及樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)的相互關(guān)系

CA16抗原通過鼻腔途徑免疫以模擬病毒自然感染途徑從而激活機(jī)體的抗病毒免疫是筆者提出的一個(gè)假說，本研究的核心即揭示CA16抗原與天然免疫的相互關(guān)系?；诳乖庖咝∈蠛粑鲤つそM織中高水平的ILC激活相關(guān)信號(hào)通路分子表達(dá)，進(jìn)一步檢測病毒抗原與天然免疫系統(tǒng)，尤其是其與ILC和DC的相互作用。對(duì)3類具有不同特征分子的ILC[30]與CA16抗原的共定位觀察表明，以GATA-3和NKp46為特征分子的ILC1在鼻腔黏膜組織中與CA16抗原共定位。與ILC1類似，在以GATA-3和RORγt為特征分子的ILC3中也觀察到CA16抗原的存在(圖4A)。但這種與CA16抗體共定位的關(guān)系并未在以GATA-3和KLRG-1為特征分子的 ILC2中觀察到。與此同時(shí)，采用免疫組織化學(xué)方法檢測ILC活化后分泌的細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)，伴隨CA16抗原出現(xiàn)，部分細(xì)胞因子如Areg、IL-1β、IL-13、IL-12、TNF-α及IFN-γ分泌增加(圖4B)。結(jié)果提示，CA16抗原進(jìn)入呼吸道黏膜組織后，明顯激活了ILC系統(tǒng)。此外，還觀察到CD11c+DC與CA16抗原有共定位關(guān)系(圖4C)。

2.5 CA16抗原經(jīng)鼻腔免疫后在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，特殊佐劑介導(dǎo)的CA16滅活抗原經(jīng)鼻腔途徑免疫可有效激活呼吸道組織中的ILC等天然免疫系統(tǒng)。據(jù)此提出疑問：ILC的免疫應(yīng)答是否能引起特異性的抗病毒免疫應(yīng)答從而保護(hù)機(jī)體？因此，進(jìn)一步比較4種免疫方式的小鼠體內(nèi)中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)指標(biāo)。結(jié)果顯示，單純的一次或兩次鼻腔免疫均可誘導(dǎo)小鼠抗CA16的血清中和抗體，但顯然僅進(jìn)行一次免疫誘導(dǎo)的抗體效價(jià)較低，幾何平均效價(jià)(geometric mean titer，GMT)僅為 1∶8 左右；而采用兩次免疫可在第二次免疫4周后誘導(dǎo)出相對(duì)較高的中和抗體，GMT達(dá) 1∶16。兩次肌內(nèi)注射免疫可誘導(dǎo)更高的中和抗體，GMT達(dá)1∶64左右。然而，采用一次肌內(nèi)注射免疫和一次鼻腔加強(qiáng)免疫的小鼠中，GMT達(dá)1∶128～1∶256(圖5A)。同時(shí)，比較各組免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的IFN-γ特異性ELISPOT反應(yīng)，結(jié)果表明抗原刺激后，各組小鼠均出現(xiàn)了明顯的特異性IFN-γ反應(yīng)細(xì)胞增殖(圖5B)。在進(jìn)一步的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)中，采用不同方式免疫的雌鼠所產(chǎn)下的乳鼠受到病毒攻擊時(shí)，顯現(xiàn)出了不同生存率，其中以肌內(nèi)注射首次免疫加鼻腔加強(qiáng)免疫的保護(hù)率最高，為100%(圖5C)。乳鼠受病毒攻擊后也表現(xiàn)出不同的臨床癥狀，對(duì)照組所有乳鼠均出現(xiàn)四肢消瘦、麻痹的現(xiàn)象，其中 22.2% 死亡；而免疫組小鼠出現(xiàn)明顯臨床癥狀的比例相對(duì)較低(表2)。綜上表明，CA16抗原通過與ILC相互作用啟動(dòng)了有效的抗病毒免疫反應(yīng)。

A: Distribution of CA16 antigens in respiratory tract tissues. Samples from mouth, nose and lung tissues were obtained at 1, 2 and 3 d after inactivated CA16 vaccine immunization. B: Expression of signaling molecules that activate ILCs in respiratory tract tissues harvested from CA16-immunized mice. Mouth, nose and lung tissue samples were obtained at 1,2 and 3 d after inactivated CA16 vaccine immunization. The results were normalized to the level of endogenous GAPDH. The y-axis indicates the relative quantity of the specific mRNA in the samples compared with the same gene in the control group (immunized with specific buffer containing 1% squalene, 3% glycerol, 5% sucrose but without viral antigen, y=1). Error bars indicate the SEM of the relative quantities.*P<0.05. C: Expression of cytokines that were secreted by ILCs in respiratory tract tissues harvested from CA16-immunized mice. Mouth, nose and lung tissue samples were obtained at 1, 2 and 3 d after inactivated CA16 vaccine immunization. The results were normalized to the level of endogenous GAPDH. The y-axis indicates the relative quantity of the specific mRNA in the samples compared with the same gene in the control group [immunized with specific buffer (containing 1% squalene, 3% glycerol, 5% sucrose) but without viral antigen, y=1]. Error bars indicate the SEM of the relative quantities.*P<0.05.

圖3CA16抗原在呼吸道組織中分布且上調(diào)ILC激活相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)

Fig.3CA16antigendistributedinrespiratorytracttissuesupregulatessignalingmoleculesforILCactivation

A: Confocal fluorescence microscopy of CA16 antigen and ILC1/ILC3 in respiratory mucosal tissues from CA16-immunized mice. Nose tissue samples were obtained at 2 d after inactivated CA16 vaccine immunization. B: Expression of immune molecules secreted by activated ILCs in respiratory tract tissues from CA16-immunized mice. Nose, mouth and lung tissue samples were obtained at 1, 2 and 3 d after inactivated CA16 vaccine immunization. Mice were immunized with specific buffer (containing 1% squalene, 3% glycerol, 5% sucrose) but without viral antigen in the control group. C: Confocal fluorescence microscopy of CA16 antigen and DCs in respiratory mucosal tissues from CA16-immunized mice. Nose, mouth and lung tissue samples were obtained at 1, 2 and 3 d after inactivated CA16 vaccine immunization.

圖4CA16抗原與ILC和DC在呼吸道黏膜組織中的相互作用

Fig.4InterrelationshipsofCA16antigenwithILCsandDCsinrespiratorymucosaltissues

表2顱內(nèi)注射病毒后乳鼠臨床癥狀的比較

Tab.2Comparisonofclinicalsymptomsofneonatalratswithintracranialinjectionofvirus

臨床癥狀對(duì)照組兩次肌內(nèi)注射免疫組一次肌內(nèi)注射免疫+一次鼻腔免疫組兩次鼻腔免疫組一次鼻腔免疫組四肢消瘦、麻痹100%0011.1%16.7%死亡22.2%0011.1%16.7%

A: Neutralizing antibody titers induced by the inactivated CA16 vaccine via different routes in mice. The samples were obtained within 56 d after inactivated CA16 vaccine immunization (arrow). B: IFN-γ-specific immune responses induced by the inactivated CA16 vaccine via different routes in mice. The samples were obtained within 28 d after booster immunization. C: Protective effects of the inactivated CA16 vaccine administered to mice via different routes. The immunized mice were challenged with CA16 on day 0. The survival rates were analyzed within 14 d of CA16 infection. Mice were immunized with specific buffer (containing 1% squalene, 3% glycerol, 5% sucrose) but without viral antigen in the control group. ns, not significant.

圖5CA16抗原經(jīng)小鼠鼻腔免疫后特異性抗CA16的免疫反應(yīng)評(píng)價(jià)

Fig.5EvaluationofspecificimmuneresponsesagainstCA16inmiceimmunizedvianasalroute

3 討論

眾所周知，ILC是一群具有免疫功能的細(xì)胞，在天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答之間建立聯(lián)系[31]。其活化依賴一些上皮黏膜組織細(xì)胞表達(dá)的信號(hào)通路分子[32]，大部分為IFN或TNF-α家族成員，通過與ILC表面的受體結(jié)合而發(fā)揮作用[33]。許多病毒通過呼吸道上皮細(xì)胞、胃腸道及尿道甚至皮膚感染機(jī)體，在這種情況下，誘導(dǎo)抗病毒免疫與ILC激活可能存在直接關(guān)聯(lián)[34]。從這個(gè)意義上講，如果病毒疫苗能模擬病毒感染路徑，則其誘導(dǎo)有效抗病毒免疫反應(yīng)的可能性大大提高。

本課題組前期關(guān)于EV71和CA16感染機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)病毒均可通過呼吸道傳播而感染靈長類動(dòng)物。因此，本研究首先以人氣管上皮細(xì)胞16HBE細(xì)胞為模型，用CA16進(jìn)行體外感染并檢測ILC激活相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)。結(jié)果顯示，16HBE被CA16感染時(shí)，細(xì)胞中IFN、TNF家族包括IFN-λ、TNF-α、RANKL、GITRL、LIGHT等表達(dá)上調(diào)。這些信號(hào)通路分子通過與ILC表面的受體結(jié)合而促進(jìn)ILC的激活[35]。然后，以特殊介質(zhì)介導(dǎo)CA16抗原進(jìn)入小鼠呼吸道上皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)天然免疫信號(hào)分子的表達(dá)變化。結(jié)果表明，以IFN、TNF家族為中心的信號(hào)分子表達(dá)趨勢與CA16感染人氣管上皮細(xì)胞類似，即細(xì)胞中ILC激活相關(guān)因子表達(dá)水平明顯上升。其后，將這種特別配制的CA16滅活抗原通過鼻腔途徑免疫小鼠，檢測ILC激活相關(guān)信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，呼吸道組織包括鼻腔、口腔及肺組織中ILC激活相關(guān)因子表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)果表明，這種新的免疫方式確實(shí)能模仿病毒感染途徑，且在感染初期能調(diào)節(jié)天然免疫系統(tǒng)。同時(shí)，對(duì)免疫后小鼠的口腔、鼻腔及肺組織進(jìn)行免疫熒光檢測，證明CA16抗原在組織中分別能與ILC1、ILC3及CD11c+DC共定位。對(duì)這些組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，觀察到活化的ILC分泌的細(xì)胞因子表達(dá)上升，也為以上推論提供了支持。以上這些結(jié)果為病毒抗原如何與天然免疫系統(tǒng)相互作用及接種疫苗后早期階段的最初免疫應(yīng)答提供了新的理解。此外，還檢測了采用不同方式免疫的小鼠體內(nèi)抗CA16中和抗體和特異性免疫應(yīng)答，結(jié)果為“CA16抗原與ILC之間的相互作用是誘導(dǎo)抗病毒免疫的起始”這一假設(shè)提供了證據(jù)。

綜上所述，CA16疫苗的研究進(jìn)展緩慢，表明人們對(duì)這類病毒感染過程及其相關(guān)免疫學(xué)反應(yīng)尚缺乏足夠認(rèn)識(shí)。基于人們對(duì)天然免疫系統(tǒng)尤其是ILC認(rèn)識(shí)的逐漸深入，本研究從CA16抗原與天然免疫反應(yīng)之間的相互關(guān)系方面探討了CA16疫苗研究的一個(gè)可能途徑。目前，盡管很多研究認(rèn)為CA16疫苗研發(fā)需較好的免疫策略及劑型，但本研究所得結(jié)果可能會(huì)加深人們對(duì)病毒抗原如何激活免疫系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，為今后疫苗研發(fā)提供新的思路。