表皮生長(zhǎng)因子受體及血漿miR相關(guān)指標(biāo)在卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義

(駐馬店市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 駐馬店 463000)

卵巢癌是常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一，發(fā)病率和致死率占婦科腫瘤的前3位[1-3]。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)和miR相關(guān)指標(biāo)在多種惡性腫瘤中均具有較高的診斷價(jià)值[4]。本文應(yīng)用熒光定量PCR法和免疫組化方法測(cè)定了EGFR及血漿miR相關(guān)指標(biāo)在卵巢癌中的表達(dá)，分析其與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取本院2015年10月至2016年10月收治的50例卵巢癌患者，年齡20～73歲，中位年齡48歲；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期患者28例，Ⅲ、Ⅳ期患者22例；漿液性腺癌患者19例，黏液性腺癌患者18例，其他患者13例；低分化20例，中分化19例，高分化11例。同時(shí)選取同一時(shí)間段到本院就診的正常卵巢者(子宮肌瘤同時(shí)行附件切除的正常卵巢組織)15例。所有患者在手術(shù)前均未接受任何放、化療治療，并經(jīng)病理學(xué)確診。

1.2主要試劑與儀器主要試劑：Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，dNTP Mixture、Oligo(dT)18、Quantitative Real-time PCR檢測(cè)試劑盒(日本TaKaRa公司)，RNase Inhibitor、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV、RNaseA(美國(guó)Promega公司)、EGFR鼠抗人單克隆抗體(深圳欣博盛生物科技有限公司)。

主要儀器：Prism?7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，METTER AE260型電子天平(德國(guó)Deltalange公司)，TGL-16型高速臺(tái)式離心機(jī)(上海醫(yī)療器械六廠)。

1.3方法

1.3.1 熒光定量PCR法測(cè)定EGFR、血漿miR相關(guān)指標(biāo)(miR-205、miR-20a及miR-29c)的mRNA水平 收集50例卵巢癌患者、15例正常卵巢者手術(shù)切除的標(biāo)本，并抽取上述研究對(duì)象空腹時(shí)的外周靜脈血，分別采用Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度及濃度，Oligo(dT)18為引物，在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下進(jìn)行cDNA的合成。在GenBank中檢索得到人源β-actin(內(nèi)參基因)、EGFR、miR-205、miR-20a及miR-29c基因序列，利用Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出PCR檢測(cè)引物，以上述cDNA為模板，采取熒光定量PCR法測(cè)定EGFR、miR-205、miR-20a及miR-29c的mRNA水平。

1.3.2 免疫組化方法測(cè)定EGFR蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá) 所有組織標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋后制作為4 μm的連續(xù)切片，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE染色和免疫組化S-P法染色，并設(shè)置陰性對(duì)照(以PBS代替一抗)和陽(yáng)性對(duì)照(已知陽(yáng)性切片)。結(jié)果判斷：細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上出現(xiàn)的棕黃色顆粒即為EGFR蛋白；根據(jù)染色細(xì)胞所占比例：0分代表無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，1分代表陽(yáng)性細(xì)胞占1%～10%，2分代表陽(yáng)性細(xì)胞占11%～50%，3分代表陽(yáng)性細(xì)胞占51%～75%，3分代表陽(yáng)性細(xì)胞占>76%。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：0分代表無(wú)染色，1分代表淡黃色，2分代表淡黃色，3分代表棕褐色。然后計(jì)算2個(gè)評(píng)分之和，0～1分為(-)，2～3分為(+)，4～5分為(++)，6～7分為(+++)，將(-)與(+)定為陰性，(++)與(+++)定為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1EGFR及血漿miR相關(guān)指標(biāo)的mRNA在卵巢癌及正常卵巢患者中的表達(dá)EGFR mRNA、miR-205 mRNA、miR-20a mRNA及miR-29c mRNA(0.83±0.12，0.71±0.08，3.64±0.23，0.68±0.05)在卵巢癌患者中的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常卵巢者(0.38±0.06，0.24±0.07，1.17±0.11，0.18±0.03)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.954,P<0.001；t=20.497,P<0.001；t=40.705,P<0.001；t=36.676,P<0.001)。

2.2EGFR蛋白在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá)EGFR蛋白在卵巢癌組織中的陽(yáng)性率(60.00%)明顯高于正常卵巢組織(13.33%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.386，P=0.007)。見(jiàn)表1。

表1 EGFR蛋白在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá)

2.3EGFR在卵巢癌患者中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系Ⅰ、Ⅱ期以及中、高分化卵巢癌患者的EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.66±0.14，0.74±0.14)明顯低于Ⅲ、Ⅳ期以及低分化患者(0.85±0.16，0.88±0.15)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.473,P<0.001；t=3.367,P=0.001)。Ⅰ、Ⅱ期及中、高分化的EGFR蛋白陽(yáng)性比例(35.71%，46.67%)明顯低于Ⅲ、Ⅳ期及低分化(90.91%，80.00%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.639，P<0.001；χ2=5.556，P=0.018)。見(jiàn)表2。

表2 EGFR在卵巢癌患者中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

2.4血漿miR相關(guān)指標(biāo)在卵巢癌患者中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系Ⅰ、Ⅱ期以及中、高分化卵巢癌患者的miR-205 mRNA、miR-20a mRNA及miR-29c mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.33±0.04、1.25±0.14、0.27±0.03以及0.37±0.04、1.26±0.11、0.26±0.03)明顯低于Ⅲ、Ⅳ期以及低分化(0.63±0.05、4.04±0.20、0.61±0.04以及0.65±0.06、4.17±0.21、0.63±0.04)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.583、P<0.001，t=55.598、P<0.001，t=33.201、P<0.001；t=18.330、P<0.001，t=56.979、P<0.001，t=35.278、P<0.001)。見(jiàn)表3。

表3 血漿miR相關(guān)指標(biāo)在卵巢癌患者中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

3 討論

EGFR作為一類(lèi)酪氨酸激酶受體，能夠進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)傳遞[5-6]。已有研究[7-8]證實(shí)，EGFR過(guò)度表達(dá)引起細(xì)胞持續(xù)增殖，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，與卵巢癌密切相關(guān)。在惡性腫瘤患者中，通過(guò)人為干預(yù)使EGFR降低后，可以明顯改善患者的病情。miR指標(biāo)是目前臨床上針對(duì)各類(lèi)腫瘤患者中研究比較熱門(mén)的指標(biāo)之一，尤其是miR-205、miR-20a及miR-29c，這些指標(biāo)同時(shí)具有原癌與抑癌雙重作用，在卵巢癌中的相關(guān)研究資料較為少見(jiàn)[9]。

本研究應(yīng)用熒光定量PCR法和免疫組化方法測(cè)定了卵巢癌患者中EGFR的mRNA和蛋白表達(dá)以及血漿miR相關(guān)指標(biāo)(miR-205、miR-20a及miR-29c)的mRNA水平。結(jié)果顯示，EGFR mRNA及蛋白、miR-205 mRNA、miR-20a mRNA及miR-29c mRNA在卵巢癌患者中的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常卵巢者。而且臨床分期越晚，組織分化程度越低，其EGFR mRNA、miR-205 mRNA、miR-20a mRNA及miR-29c mRNA的相對(duì)表達(dá)量越高，EGFR蛋白的陽(yáng)性率也越高。這提示EGFR與血漿miR相關(guān)指標(biāo)表達(dá)越強(qiáng)，卵巢癌惡性程度越高，充分說(shuō)明EGFR與血漿miR相關(guān)指標(biāo)與卵巢癌的臨床分期與分化程度密切相關(guān)。因此EGFR與血漿miR相關(guān)指標(biāo)均能作為判斷卵巢癌的指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)EGFR與血漿miR相關(guān)指標(biāo)有助于卵巢癌的早期診斷，及早進(jìn)行針對(duì)性治療。

綜上所述，EGFR與血漿miR相關(guān)指標(biāo)均與卵巢癌的發(fā)生均有密切的關(guān)系，對(duì)于卵巢癌的臨床分期與分化程度具有較高的檢測(cè)意義。