液-液微萃取結合氣相色譜-質譜聯(lián)用技術快速測定飲料酒中揮發(fā)性酚類化合物

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(1.中國貴州茅臺酒廠(集團)有限責任公司，貴州仁懷 564501；2.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州仁懷 564501)

揮發(fā)性酚類化合物是飲料酒中的重要風味物質，其對于酒的聞香、口感以及穩(wěn)定性等方面具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)香草醛、4-乙基苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-丙基愈創(chuàng)木酚在朗姆酒中的香氣強度(OAV)≥1[1]；愈創(chuàng)木酚和香草醛是威士忌關鍵香氣的組成成分[2 - 3]；葡萄酒中4-乙基苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚兩種酚類總濃度小于400μg/L時貢獻辛香、煙熏香等，大于620μg/L時會給酒樣帶來“酚味”、“動物臭”、“馬廄臭”等風味缺陷[4 - 5]。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)受林火煙霧污染的葡萄會給酒體帶來高濃度酚類物質，從而出現(xiàn)煙熏味、灰燼味以及燒焦味等缺陷風味[6]。酚類物質對中國白酒的風味影響同樣倍受關注，近幾年的研究認為4-甲基苯酚主要與濃香型白酒窖泥及白酒中異嗅有關，但相關研究還較少[7 - 8]。因此，快速、準確定性定量分析酒精類飲料中揮發(fā)性酚類化合物對風味研究具有重要意義。

目前，已報道的酒精類飲料中揮發(fā)性酚類化合物測定方法，主要是各種預處理方法與氣相色譜或液相色譜聯(lián)用，如浸入式固相微萃取(DI-SPME)[9]、攪拌棒吸附萃取(SBSE)[10]、液-液萃取(LLE)[11]、C18固相萃取[12]，結合氣相色譜-質譜(GC-MS)法；LLE結合高效液相色譜(HPLC)分離，采用熒光檢測器(FLD)或二極管陣列檢測器(DAD)測定[13 - 14]。DI-SPME、SBSE方法操作簡便，但存在競爭吸附，影響低含量酚類物質檢測的靈敏度，HPLC主要適用于難揮發(fā)性酚類化合物分析，LLE及C18固相萃取的方法需要氮吹濃縮、洗脫等步驟，有機溶劑用量較大。液-液微萃取(LLME)作為一種預處理方式，具有萃取效率高、操作方便、儀器條件要求低、有機溶劑用量少等優(yōu)點，但目前在酚類化合物分析方面的應用還未見報道。

本研究采用直接LLME，對萃取溶劑種類、用量、萃取酒精度、萃取pH等條件進行優(yōu)化選擇，最終有機相可直接進樣分析，無需氮吹濃縮步驟，建立了一種準確、快速定性定量分析飲料酒中揮發(fā)性酚類化合物的方法。本方法對于酒精度大于10%vol的酒樣先進行稀釋降度，對于酒精度小于10%vol的飲料酒無需進行稀釋。并使用該方法分析了市場上不同白酒及威士忌樣品中的揮發(fā)性酚類化合物，結果表明，所測得9種揮發(fā)揮發(fā)性酚類化合物在不同類型酒精飲料中含量分布差異較大。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AgilentGC7890A-5975MSD氣相色譜-質譜聯(lián)用儀；VORTEX-GENIE2渦旋振蕩器；梅特勒公司MS1602TS分析天平；艾科普AFX-2002-U超純水純化系統(tǒng)。

標準品：苯酚(Phenol)、4-甲基苯酚(4-Methylphenol)、4-乙基苯酚(4-Ethylphenol)、愈創(chuàng)木酚(Guaiacol)、4-甲基愈創(chuàng)木酚(4-Methylguaiacol)、4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-Ethylguaiacol)、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(4-Vinylguaiacol)、香草醛(Vanillin)、香草酸乙酯(Vanilicacidethylester)、3,4-二甲基苯酚(3,4-Dimethylphenol，內標)，純度均大于99%，均購自美國Sigma-Aldrich公司。標準溶液及內標溶液配制：分別準確稱取適量標準品，用乙醇配成濃度約為10000mg/L標準品儲備溶液，置于4℃冰箱中保存待用。乙醚(分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司)；戊烷(色譜純，美國天地公司)，重蒸后使用；NaCl(分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司)；乙醇(色譜純，純度99.9%，ACS公司)。水為超純水。

酒樣：市售醬香型白酒、濃香型白酒、清香型白酒、威士忌。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品預處理準確吸取5 mL酒樣于40 mL樣品瓶中，加超純水稀釋酒精度至10% vol，再加入8.5 g NaCl進行飽和，加入2 μL 3,4-二甲基苯酚溶液作為內標，然后加入萃取劑，渦旋振蕩1 min，靜置分層，吸取上層有機相進行氣相色譜-質譜分析。

1.2.2儀器條件氣相色譜條件：DB-FFAP毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度為230 ℃，載氣為氦氣，流速1.3 mL/min，進樣量為1 μL，不分流進樣；升溫程序：40 ℃，不保持；1 ℃/min升至50 ℃；5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。質譜條件：離子源(EI)，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，采集模式為全掃描模式(SCAN)及選擇離子監(jiān)測模式(SIM)，SCAN用于定性，SIM用于定量。定量離子的選擇兼顧每種化合物碎片離子的特異性及豐度，排除干擾的同時提高靈敏度，詳細參數(shù)見表1，檢索譜庫為NIST 14a.L。

表1 選擇離子監(jiān)測模式條件

1.2.3定性與定量分析采用SIM的方法對9種酚類化合物進行積分，以標準品與內標峰面積之比為橫坐標(x)，標準品濃度與內標濃度之比為縱坐標(y)，繪制標準曲線。以3,4-二甲基苯酚為內標通過標準曲線進行定量分析。以53%乙醇-水溶液為基質，將9種待測酚類物質標準品配制成混合標準儲備溶液，采用兩倍稀釋法得到一系列不同濃度的標準溶液。將待測樣品按照1.2.1方法進行預處理后，吸取上層有機相進樣分析，按照標準曲線計算樣品中待測物濃度。

2 結果與討論

2.1 液-液微萃取方法的建立

圖1 萃取溶劑的選擇Fig.1 Selection of extraction solvent

2.1.1萃取溶劑的選擇由于待測酚類化合物種類較多，選擇的萃取溶劑需兼顧多種酚類的萃取效果。乙醚與戊烷是白酒分析常用、且效果較好的極性與非極性萃取溶劑，實驗比較了乙醚、戊烷、乙醚-戊烷(體積比1∶1)分別為萃取溶劑時酚類化合物的萃取效果(圖1)，以能夠檢測到的酚類化合物種類及總峰面積為考量指標。結果表明，采用乙醚為萃取溶劑時，酚類化合物萃取效果最佳，乙醚與酚類化合物同屬極性化合物，戊烷為非極性溶劑，根據(jù)相似相溶原理，乙醚萃取效果優(yōu)于戊烷，實驗結果與之相符，選擇乙醚作為萃取溶劑。

2.1.2萃取溶劑用量及萃取級數(shù)的選擇酚類化合物在白酒中為微量成分，因此酒樣用量不宜過少，同時考慮方法的操作便捷性，選擇酒樣用量為5 mL，在滿足萃取效率及操作便捷性的同時，減少萃取劑用量可省去氮吹濃縮步驟，且環(huán)保性好。當有機溶劑為1 mL時，吸取上層有機相較困難，因此選擇萃取溶劑用量為2 mL。為保證萃取效率，實驗考察了多級萃取的效果，以乙醚為萃取劑，每次加入2 mL，共萃取3次。結果顯示：除愈創(chuàng)木酚及香草醛一次萃取效率略低于90%，其余7種酚類物質一次萃取效率均在90%以上，總酚類的萃取效率也在90%以上(圖2)，第三級萃取峰面積相對前兩次可忽略不計(<3%)。因此方法選擇2 mL萃取溶劑萃取一次。

2.1.3萃取酒精度的選擇由于酒精度影響萃取效果，實驗采用加水稀釋的方法降低樣品的酒精度，分別比較了在5% vol、10% vol、15% vol、20% vol 4種酒精度條件下能夠檢測到的酚類化合物種類數(shù)及總峰面積(圖3)。結果顯示，低的酒精度利于酚類物質的萃取，酒精度過高時，目標物萃取分離效果差，隨著酒精度的降低，酚類物質響應及種類呈上升趨勢，當酒精度為10% vol與5% vol時，能夠檢測到的酚類化合物種類相同，酚類總峰面積也基本相同，兼顧操作的便捷性及分析成本，實驗選擇萃取酒精度為10% vol。根據(jù)這一實驗結果，我們也可以知道對于酒精度低于10% vol的飲料酒，可直接進行萃取，無需稀釋步驟。

圖2 萃取級數(shù)的選擇Fig.2 Selection of extraction frequency

圖3 酒精度的選擇Fig.3 Selection of alcohol concentration

圖4 萃取pH的選擇Fig.4 Selection of pH

2.1.4萃取pH條件的選擇酚類物質帶有酚羥基，一般呈弱酸性，但白酒中同時含有豐富的有機酸，與酚類物質性質相近，且酚類物質與高級脂肪酸酯出峰時間相近，這些都會對酚類物質分析造成干擾，因此實驗通過調整不同的pH以期減少有機酸的干擾，提高酚類物質萃取效率。實驗采用10%NaHCO3溶液及0.1 mol/L H2SO4對加水稀釋后的酒樣pH進行調節(jié)。實驗分別比較了pH為1、3、5及7時酚類的萃取效果(圖4)，其中pH=3為不進行調節(jié)時酒樣的原始pH。結果表明，pH=3時，9種酚類的萃取效果均最佳。當pH為5、7時，雖然可適當減小有機酸的影響，但酚羥基可能也被部分中和，因此選擇萃取pH條件為3，即不進行pH調節(jié)。

圖5 9種酚類化合物的總離子流(TIC)色譜圖Fig.5 TIC chromatogram of 9 phenol compounds1.Guaiacol;2.4-Methylguaiacol;3.Phenol;4.4-ethylguaiacol;5.4-Methylphenol;6.4-Ethylphenol;7.4-Vinylguaiacol;8.3,4-Dimethylphenol;9.Vanillin;10.Vanilicacidethylester.

綜上，優(yōu)化條件下，9種酚類物質混合標準溶液的SIM總離子流色譜圖如圖5，可以看出9種酚類物質均具有較好的峰形，且能達到良好的分離效果。

2.2 方法評價

2.2.1線性范圍、檢出限與定量限按照1.2.3方法繪制標準曲線，9種揮發(fā)性酚類化合物在一定濃度范圍內均呈現(xiàn)良好的線性關系(R2≥0.997)。按3倍和10倍信噪比計算得到9種酚類化合物的檢出限(S/N≥3)及定量限(S/N≥10)，用標準工作曲線對待測樣品中待測組分進行內標法定量，樣品的響應值應在標準工作曲線的線性范圍內，結果見表2。

2.2.2回收率與精密度本方法采用加入回收試驗進行準確度和精密度的評價。以酚類化合物含量較低的酒樣為基質，分別按照高、中、低3個濃度水平進行加標回收率測定，每個水平做6個平行，各化合物回收率及精密度見表3。結果表明：9種酚類化合物不同濃度的添加回收率為88.3%～108.6%，相對標準偏差(RSD)為0.6%～6.4%。本方法的準確度和精密度均符合有關標準和法規(guī)的要求。

表2 9種酚類化合物的線性范圍、線性關系、檢出限(LODs)及定量限(LOQs)

表3 9種酚類化合物的加標回收率及相對標準偏差(RSDs)(n=6)

(續(xù)表3)

CompoundSpiked(μg/L)Background(μg/L)Recovery(%)RSD(%)196.891.35.6106.0103.16.4Vanilicacidethylester28.111.288.10.718.789.92.29.35103.90.8

2.3 實際樣品的測定

應用本方法對市售不同香型白酒樣品以及威士忌樣品進行分析，其中醬香型白酒樣品(Maotai-flavor liquor)30個、濃香型白酒樣品(Luzhou-flavor liquor)28個、清香型白酒樣品(Fen-flavor liquor)6個、威士忌樣品(Whiskey)5個，共計69個樣品，結果見表4。

表4 市售樣品中揮發(fā)性酚類化合物

從表4可知，不同飲料酒中酚類化合物種類、含量間存在顯著差異，9種揮發(fā)性酚類物質在清香型白酒及威士忌中均有檢出，但含量存在差異。苯酚、4-甲基苯酚存在于所有醬香型、濃香型、清香型及威士忌樣品中，從含量上講，這兩種酚類為酒精飲料中最主要的兩種酚類化合物。苯酚、4-甲基苯酚及4-乙基苯酚在濃香型白酒中含量明顯高于清香型及醬香型白酒，尤其4-甲基苯酚，可能與濃香型白酒所用窖泥及其工藝特點有關。醬香型白酒中愈創(chuàng)木酚含量與威士忌基本持平，含量范圍0～399.0 μg/L，高于濃香型白酒(0～41.7 μg/L)與清香型白酒(30.6～60.1 μg/L)，而張燦[8]采用的檢測方法在醬香型白酒中均未檢出愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，說明本文方法靈敏度更高。威士忌中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香草醛及香草酸乙酯含量范圍分別為129.0～212.9 μg/L，1154.2～2180.3 μg/L和131.1～279.2 μg/L，含量明顯高于其它幾種酒類，這與其儲存容器橡木桶有關[15]。

3 結論

本研究采用液-液微萃取結合氣相色譜-質譜聯(lián)用技術，建立了一種快速、準確定性定量分析白酒中酚類物質的方法。采用該方法檢測了64種市售不同香型中國白酒以及5種威士忌樣品，結果表明，該方法在白酒及威士忌樣品中均適用，所測9種酚類物質在不同類型酒精飲料中含量分布差異較大。濃香型白酒中苯酚、4-甲基苯酚及4-乙基苯酚含量較高，威士忌中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香草醛及香草酸乙酯含量明顯高于其它幾種酒類。本方法可為酒精類飲料中酚類物質的研究提供方法參考。