在線固相萃取-超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定飲用水中8種精神類藥物

， ， ， ， ，

(北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，北京 100026)

目前，醫(yī)藥行業(yè)快速發(fā)展，據(jù)統(tǒng)計全球目前有4500多種藥物被用于人類和動物的疾病預(yù)防和治療[1]。這些藥物盡管沒有傳統(tǒng)持久性有機(jī)污染物(POPs)的半衰期長，但隨著人類的使用被持續(xù)不斷的進(jìn)入到環(huán)境中，使其在低濃度下產(chǎn)生的細(xì)微作用累積放大，對微生物、動植物和人類的生態(tài)毒性逐漸顯現(xiàn)出來[2 - 3]。近些年，在地表水[4]、地下水[5]和飲用水[6]等多種水環(huán)境中檢測出了多種精神類藥物殘留。Lindberg等[7]研究表明，污水處理廠對污水中的精神類藥物降解率低，未去除的這類化合物經(jīng)過地表與地下水循環(huán)體系污染人類的飲用水水源，給人類健康和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的危害[8 - 9]。

近幾年，為使國內(nèi)抑郁癥和癲癇患者得到有效治療，這兩類藥物的生產(chǎn)和銷量不斷增加，因此，水環(huán)境中精神類藥物污染情況開始受到人們的關(guān)注。但水中這類藥物濃度較低，需要預(yù)富集以滿足儀器分析要求。目前，水中抗抑郁藥主要前處理富集方法包括液-液萃取法[10]、固相萃取法[11 - 12]和液-液微萃取法[13]。儀器檢測方法主要包括液相色譜法[14]和液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法[15]。本文采用在線固相萃取-超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法(OnlineSPE-UPLC-MS/MS)測定飲用水中常見的6種抗抑郁類藥物阿米替林、舍曲林、帕羅西汀、阿利馬嗪、氯米帕明和氟西汀和2種抗癲癇類(奧卡西平、卡馬西平)。該方法快速準(zhǔn)確，靈敏度高，并應(yīng)用該方法對北京市部分飲用水源地采集的水樣進(jìn)行了檢測，為飲用水的水質(zhì)安全風(fēng)險評估和法規(guī)制定提供必要的技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WatersAcquityXevoTQ-S液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Waters公司)；在線固相萃取裝置(美國，Waters公司)，配2777C自動進(jìn)樣器；尼龍材質(zhì)針筒式微孔濾膜(直徑13mm、0.22μm)(美國,PALL公司)。

甲醇、乙腈(色譜純)(美國Fisher公司)；甲酸(色譜純)(美國Tedia公司)。實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)(美國，Millipore公司)過濾的超純水(18.2MΩ·cm)。

8種目標(biāo)分析物標(biāo)樣信息詳見表1(純度≥95.0%，美國，Sigma-Aldrich)，以甲醇溶液分別配制質(zhì)量濃度為10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃保存，臨用時配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

表1 精神類藥物基本信息和質(zhì)譜采集參數(shù)

1.2 樣品前處理

水樣經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后用，甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，將溶液轉(zhuǎn)移至20 mL進(jìn)樣瓶中，在線固相萃取(Online SPE)裝置吸取5 mL樣品溶液進(jìn)行凈化富集，隨后直接進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.3 在線固相萃取條件

Oasis?HLB柱 (30×2.1 mm,20 μm)；進(jìn)樣體積：5 mL；流動相A：1%甲酸水溶液；流動相B：甲醇/丙酮/正己烷(1/1/1，V/V/V)。Online SPE淋洗程序：0～0.5 min，2.00 mL/min，100%A；0.5～3.5 min，2.00～0.01 mL/min，100%A；3.5～4.5 min，0.01～2.00 mL/min，100%～0%A；4.5～7.5 min，0.01～2.00 mL/min，100%～0%A；7.5～13 min，2.00 mL/min，100%A。

1.4 超高效液相色譜條件

ACQUITY UPLCHSS T3色譜柱(100×2.1 mm，1.7 μm；Waters，USA)；柱溫：40 ℃；流動相A：0.5%甲酸水溶液，流動相B：乙腈；流速及梯度洗脫程序：0～4 min，0.1 mL/min，90%A；4～4.5 min，0.1～0.4 mL/min，90%A；4.5～9.5 min，0.4 mL/min，90%～10%A；9.5～10.5 min，0.4 mL/min，10%A；10.5～12 min，0.4 mL/min，10%～90%A；12～13 min，0.4 mL/min，90%A。

1.5 質(zhì)譜條件

采用電噴霧正離子模式(ESI+)電離；多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓：1.00 kV；去溶劑氣溫度：500 ℃；去溶劑氣流速：1 000 L/Hr；碰撞氣流速：0.14 mL/min；離子源溫度：150 ℃；霧化氣壓力：600 kPa。

1.6 樣品數(shù)據(jù)處理

采用外標(biāo)法定量，所有數(shù)據(jù)使用Waters MassLynx Software Ver.4.1(Waters Inc,USA)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品基質(zhì)的選擇

飲用水所涵蓋的領(lǐng)域非常廣泛，并且有很多的分類。根據(jù)我國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 19298-2014)[16]，選取飲用純凈水和其他飲用水兩種基質(zhì)。鑒于礦泉水管理方式的不同，取水地點(diǎn)、水源地保護(hù)、加工過程等有嚴(yán)格的特異性規(guī)定[17]，將飲用天然礦泉水也加入到實驗樣品基質(zhì)中。故最終確定實驗的三種基質(zhì)：飲用純凈水、飲用天然礦泉水和其他飲用水。

2.2 微孔濾膜的選擇

為避免樣品中的微小顆粒造成實驗儀器管路的堵塞，實驗中樣品需先通過微孔濾膜進(jìn)行過濾。分別考察了三種型號的0.22 μm微孔濾膜：PP、Nylon和GHP。向三種基質(zhì)的陰性樣品中添加8種目標(biāo)化合物，濃度均為10 ng/L，分別通過上述三種型號的微孔濾膜。實驗結(jié)果表明，Nylon膜過濾后有7種化合物的響應(yīng)值是PP膜和GHP膜的1倍至2倍。故選用0.22 μm Nylon材質(zhì)的微孔濾膜進(jìn)行水樣的過濾。

2.3 在線固相萃取條件的優(yōu)化

2.3.1樣液pH值和固相萃取柱的確定本實驗采用Online SPE柱對樣品中目標(biāo)化合物進(jìn)行富集，實驗中考察了不同pH值(3、7和10)的樣品溶液經(jīng)過C18和HLB兩種材料Online SPE后的富集效果。實驗結(jié)果表明：上樣液pH值為7和10時，兩種SPE柱的提取效率在60%～120%之間的藥物數(shù)量只有1～4種。在pH值為3時，8種目標(biāo)化合物經(jīng)過HLB柱后的回收率為68.9%～105.8%，但經(jīng)C18柱富集后的目標(biāo)化合物回收率均低于50%。故實驗最終確定將樣品調(diào)節(jié)至pH=3.0，并使用HLB柱作為本實驗的Online SPE柱。

2.3.2淋洗液和洗脫液的優(yōu)化Online SPE裝置將樣品注入SPE柱后，該裝置流動相與SPE柱連接，淋洗液通過SPE柱進(jìn)行淋洗。本實驗中嘗試在1%甲酸水溶液中加入5%的乙腈溶液，結(jié)果顯示，8種目標(biāo)化合物在質(zhì)譜檢測中沒有出峰，說明淋洗液中的有機(jī)相比例過高，目標(biāo)化合物在淋洗過程中無法保留在SPE柱上，故最終采用1%甲酸溶液水作為淋洗液。

SPE柱經(jīng)過淋洗后，裝置進(jìn)行閥切換，將液相色譜流動相與SPE柱連接，該流動相將目標(biāo)化合物反沖到色譜柱上進(jìn)行分離，故SPE柱的洗脫液就是液相色譜的流動相溶液，其優(yōu)化條件參見“2.4.2流動相的優(yōu)化”。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

2.4.1色譜柱的選擇樣品經(jīng)過富集后進(jìn)入液相色譜柱進(jìn)行進(jìn)一步分離，為使8種目標(biāo)化合物得到較好的峰形和分離效果，實驗中分別比較了ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100×2.1 mm,1.7 μm)和ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100×2.1 mm,1.7 μm)兩種色譜柱。結(jié)果表明：8種化合物經(jīng)兩種色譜柱分離后的色譜峰形對稱，保留良好。從出峰時間比較，C18色譜柱上的保留時間較T3色譜柱提前0.1～0.4 min，8種化合物在T3色譜柱上保留較強(qiáng)。從響應(yīng)值強(qiáng)度比較，T3色譜柱分離的化合物中有6種化合物的響應(yīng)值是C18色譜柱的1至2倍。因此實驗選擇ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱作為色譜分離柱。

2.4.2流動相的優(yōu)化分別考察0.5%甲酸水溶液-乙腈、0.5%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈和0.5%甲酸-0.1%乙酸銨水溶液-乙腈4種不同流動相條件下，8種化合物的出峰情況。實驗結(jié)果表明：使用0.5%甲酸水溶液-甲醇作為流動相，只有2種目標(biāo)化合物被檢測出來，且定量限較高。其余三種流動相條件下均能將8種目標(biāo)化合物洗脫出來，而在0.5%甲酸水溶液-乙腈流動相條件下，其響應(yīng)值分別是其余兩種流動相條件下的2至4倍左右。故選取0.5%甲酸水溶液-乙腈作為SPE凈化富集和色譜分離的洗脫溶液。各物質(zhì)的保留時間見表1。

2.5 質(zhì)譜條件的確定

采用電噴霧(ESI)離子源，8種化合物均在正離子模式下電離，通過總離子流色譜圖(圖1)可以看出，8種化合物形成的準(zhǔn)分子離子峰中[M+H]+峰豐度最高。參考?xì)W盟2002/657/EC 指令[18],以準(zhǔn)分子離子為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,選擇豐度較高的兩個碎片離子作為定量和定性離子,分別優(yōu)化各個離子對的錐孔電壓(Cone Voltage)及碰撞能量(Collision Energy)。優(yōu)化去溶劑氣溫度及流量、碰撞氣溫度、霧化氣壓力、毛細(xì)管電壓和離子源溫度，使所有離子對獲得最強(qiáng)響應(yīng)信號。比較每對離子的強(qiáng)度和穩(wěn)定性，最終選擇響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為定量子離子。8種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

圖1 8種藥物的總離子流(TIC)色譜圖Fig.1 TIC chromatograms of 8 pharmaceuticals

2.6 線性范圍和定量限

將8種目標(biāo)物配制成0.1、0.2、0.5、5、10、20 ng/L 6個濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別得到對應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過向沒有目標(biāo)物的樣品基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按10倍信噪比進(jìn)行定量限(LOQ)的計算，每種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和LOQ見表2。由表2可看出，這8種化合物在線性范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R)均大于0.995，靈敏度較高。

表2 8種藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限(LOQ)

2.7 方法的準(zhǔn)確度與精密度

對飲用純凈水、其他飲用水和飲用天然礦泉水三種基質(zhì)陰性樣品分別進(jìn)行了8種化合物的添加回收實驗，分別選取0.1 ng/L和1 ng/L作為加標(biāo)水平，每個添加水平進(jìn)行6次平行實驗，外標(biāo)法定量，計算得到平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，實驗結(jié)果見表3。從表3可以看出，在選定的2個水平下，添加回收率在68.9%～105.8%之間，RSD在3.6%～13.6%之間，滿足方法學(xué)的要求。

表3 飲用純凈水、其他飲用水和飲用天然礦泉水中8種藥物加入回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=6)

(續(xù)表3)

CompoundSpiked level(ng/L)Drinking pure waterDrinking natural mineral waterOther drinking waterRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Alimemazine0.180.49.988.812.4105.87.61.099.64.786.73.681.37.3Clomipramine0.185.19.6102.85.884.011.01.078.57.178.59.486.65.7Fluoxetine0.187.99.079.410.068.96.41.082.53.677.17.780.86.7

2.8 實際水樣的測定

應(yīng)用本實驗方法對北京市部分飲用水源地采集的39份水樣進(jìn)行8種目標(biāo)物殘留檢測。結(jié)果顯示，在39份水樣中有8份樣品檢測出奧卡西平，濃度范圍為1.4～8.2 ng/L；有14份樣品檢測出卡馬西平，濃度范圍為0.21～4.6 ng/L，其余6種目標(biāo)物測定結(jié)果低于檢出限。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中卡馬西平的MRM參考色譜圖見圖2。

圖2 卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品(a)和樣品中卡馬西平(b)的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of carbamazepine standard(a) and carbamazepine in sample(b)

3 結(jié)論

本研究建立了飲用水中8種常見精神類藥物的在線固相萃取-超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。該方法簡便快捷，節(jié)省人力，滿足靈敏度和精密度的要求。應(yīng)用本方法對北京市飲用水源水樣品進(jìn)行藥物殘留分析，8份樣品檢測出奧卡西平，14份樣品檢測出卡馬西平。這些測定數(shù)據(jù)的積累可以為今后飲用水水質(zhì)安全風(fēng)險評估和法規(guī)制定提供必要的技術(shù)支撐。