人血漿N-糖鏈超高效液相色譜檢測(cè)方法的優(yōu)化

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(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095)

人體血漿N-糖鏈結(jié)構(gòu)和含量會(huì)因人體健康狀況而異，因此血漿中N-糖鏈成為臨床上診斷和監(jiān)測(cè)多種疾病發(fā)生和發(fā)展的新的重要標(biāo)志物。研究表明，N-糖鏈結(jié)構(gòu)和含量的改變與疾病，例如炎癥反應(yīng)和癌癥等密切相關(guān)[1 - 3]。人血漿中的N-糖鏈結(jié)構(gòu)具有多樣性，以復(fù)雜型N-糖鏈為主，也含有少量高甘露糖型和雜合型糖鏈。人血漿樣品中的N-糖鏈富含末端唾液酸修飾。但唾液酸的性質(zhì)不穩(wěn)定，容易在酸堿條件下解離[4]。

目前除了直接使用質(zhì)譜分析，國(guó)內(nèi)外糖蛋白N-糖鏈的分析多采用液相色譜對(duì)糖鏈進(jìn)行分離，然后使用在線或離線質(zhì)譜對(duì)分離的同分異構(gòu)體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，因此靈敏度和分辨率更高的高效液相色譜技術(shù)越來(lái)越普遍的應(yīng)用于N-糖鏈的分析中[5 - 7]。常用的N-糖鏈的分析主要由樣品前處理、酶法或化學(xué)法糖鏈釋放、糖鏈熒光標(biāo)記及高效液相色譜檢測(cè)等部分組成[8]。Barbara等[9]對(duì)人血漿中纖維蛋白原的N-連接糖鏈的分析中，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)纖維蛋白進(jìn)行分離純化，直接使用N-糖酰胺酶F(PNGaseF)釋放糖鏈后，采用超高效液相色譜(UPLC)進(jìn)行分析。Wang等[10]在有關(guān)牛乳和人乳蛋白結(jié)合N-連接寡糖抗病原體活性的研究中，采取三氯乙酸(TCA)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行沉淀并洗滌去除游離糖之后進(jìn)行液相色譜分析。本實(shí)驗(yàn)選取N-糖鏈檢測(cè)方法的三個(gè)步驟，包括樣品前處理方法、標(biāo)記時(shí)間和進(jìn)樣濃度，對(duì)N-糖鏈的親水性高效液相色譜分析方法進(jìn)行了優(yōu)化，并用于人血漿樣品中N-糖鏈分析。該方法日內(nèi)和日間重復(fù)性無(wú)顯著差異，適用于富含唾液酸的人血漿樣品的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

UltrafileXtremeMALDI-TOF質(zhì)譜儀(德國(guó)，Bruker公司)；LC-30AD超高效液相色譜儀(日本，Shimadzu)，配RF-20Axs熒光檢測(cè)器。

2,5-二羥基苯甲酸(DHB)、2-氨基苯甲酸胺(2-AB)、SupelcleanTMENVI-CarbTM預(yù)裝碳柱均購(gòu)自美國(guó)西格瑪公司。唾液酸酶(GlykoTMSialidaseA)購(gòu)自Prozyme公司。N-糖酰胺酶F(PNGaseF)由本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化。乙腈、甲酸、氨水均為色譜純，購(gòu)自默克公司。其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

人血漿采集自健康自愿者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1血漿樣品前處理直接加熱變性法：取200 μL血漿，加入128 μL去離子水，23 μL 500 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)，12.5 μL變性劑(2%SDS水溶液，7%β-巰基乙醇)，95 ℃加熱變性10 min。三氯乙酸(TCA)沉淀法：取200 μL 40%TCA溶液與200 μL血漿混合，12 500 r/min離心30 min，移去上清液，加入1 mL去離子水，振蕩重懸，離心并棄去上清液，重復(fù)操作洗滌沉淀5次。氯仿/甲醇沉淀法：200 μL血漿加入氯仿/甲醇(體積比1∶2∶1)，振蕩混勻，12 500 r/min離心20 min后，取中間層固體，加入1 mL 去離子水，振蕩重懸，離心并棄去上清液，重復(fù)操作洗滌沉淀5次。

1.2.2N-糖酰胺酶F消化釋放糖鏈直接加熱變性樣品，加入50 μL PNGase F與19 μL 10%Triton X-100水溶液，37 ℃消化過(guò)夜。TCA沉淀法和氯仿/甲醇沉淀法所得固體沉淀，加入200 μL去離子水振蕩重懸，再加入128 μL去離子水、23 μL 500 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)、12.5 μL變性劑(2%SDS水溶液，7%β-巰基乙醇)，50 μL PNGase F與19 μL 10% Triton X-100水溶液，37 ℃消化過(guò)夜。

1.2.3N-糖鏈的純化和熒光標(biāo)記N-糖酰胺酶F消化樣品，12 500 r/min離心20 min，取上清液加入活化的SupelcleanTMENVI-CarbTM預(yù)裝碳柱，滴凈；加入3 mL去離子水，滴凈；再依次加入1.5 mL 20%乙腈和1.5 mL 40%乙腈，分別收集，合并洗脫液，使用真空離心旋干機(jī)旋干樣品。干燥樣品中加入10 μL的2-AB標(biāo)記液(35 mmol/L 2-AB、0.1 mol/L氰基硼氫化鈉溶于DMSO-冰HAc混合溶液(體積比7∶3)，充分混合)，65 ℃金屬浴反應(yīng)4 h。反應(yīng)產(chǎn)物中加入40 μL去離子水稀釋,待用。

1.2.4熒光標(biāo)記糖鏈的超高效液相色譜(UPLC)檢測(cè)10 μL稀釋的2-AB標(biāo)記產(chǎn)物加入40 μL不同濃度的乙腈水溶液，使乙腈終濃度(體積分?jǐn)?shù))分別為20%、40%、60%和80%，12 500 r/min離心2 min，取40 μL上清液用于UPLC分析。色譜條件為：Acquity BEH糖化柱(150×2.1 mm，1.7 μm；Waters)，柱溫60 ℃；流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量為40 μL；流動(dòng)相A為50 mmol/L甲酸銨緩沖液(pH=4.5)，流動(dòng)相B為乙腈；熒光檢測(cè)器波長(zhǎng)為Ex/Em=330/420 nm；洗脫程序：0～6 min，流動(dòng)相A由5%線性升至12%；6～45 min，流動(dòng)相A比例進(jìn)一步線性提升至44%；46～49 min，流動(dòng)相A提升為100%并維持1 min；51～58 min，流動(dòng)相A比例降至5%并維持7 min。

1.2.5唾液酸酶處理10 μL稀釋的2-AB標(biāo)記產(chǎn)物加入1 μL GlykoTMSialidase A，5 μL去離子水，4 μL 酶切緩沖液，37 ℃消化過(guò)夜。酶切產(chǎn)物采取1.2.4所述液相色譜方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析根據(jù)UPLC譜圖，對(duì)色譜各峰進(jìn)行收集，使用真空離心干燥機(jī)旋干。旋干的樣品中加入3 μL去離子水，充分混勻，取出1 μL，與1 μL DHB基質(zhì)混勻，點(diǎn)樣于板上，風(fēng)干后，質(zhì)譜檢測(cè)。以馬心肌肌紅蛋白的胰蛋白酶酶解肽段為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正。正離子模式質(zhì)譜條件為：離子加速電壓20 kV，質(zhì)荷比掃描范圍m/z800～3 000，采集數(shù)據(jù)所用激光的能量為6 000。負(fù)離子模式的條件為：離子加速電壓20 kV，質(zhì)荷比掃描范圍m/z2 000～4 000，采集數(shù)據(jù)所用激光的能量為6 000。由總激光發(fā)射脈沖次數(shù)為3 000的質(zhì)譜圖累加而得到所需的質(zhì)譜圖。采用Bruker Flexanalysis 3.3分析軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并使用GlycoWorkbench糖結(jié)構(gòu)分析軟件對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行推導(dǎo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 血漿樣品蛋白結(jié)合N-糖鏈檢測(cè)方法的優(yōu)化

2.1.1樣品處理方法的優(yōu)化在樣品前處理階段，本實(shí)試驗(yàn)比較了常用的三種樣品處理方法，其中TCA沉淀法采用了酸性溶液，氯仿/甲醇沉淀法使用了有機(jī)溶劑，直接加熱法涉及高溫條件[11 - 12]。如圖1A所示，與TCA沉淀法和氯仿/甲醇沉淀法相比，直接加熱法在保留時(shí)間28 min以后的各色譜峰面積所占比例明顯高于另外兩種前處理方法，尤其是保留時(shí)間為28.2、34.3和35.6 min的色譜峰。后續(xù)對(duì)各色譜峰所含N-糖鏈的結(jié)構(gòu)分析顯示，28 min以前的各色譜峰主要以中性糖為主，而28 min以后各峰含有大量具有唾液酸修飾的N-糖鏈。推斷TCA或者有機(jī)溶劑處理可能會(huì)引起部分唾液酸的解離，從而導(dǎo)致UPLC檢測(cè)時(shí)含唾液酸的色譜峰面積所占比例下降。而直接加熱處理處理時(shí)間較短，且pH值近中性，并未引起唾液酸的劇烈剝離。此外，與另外兩種操作相比直接加熱法流程更加簡(jiǎn)單，減少了蛋白樣品的損失和糖鏈的降解。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取直接加熱法處理血漿樣品。

2.1.2熒光標(biāo)記時(shí)間25 μL血漿樣品經(jīng)直接加熱變性前處理后使用PNGase F消化，使得N-糖鏈從蛋白上解離下來(lái)。釋放的N-糖鏈再經(jīng)過(guò)固相萃取碳柱的純化，去除蛋白和鹽。旋干后，N-糖鏈?zhǔn)褂脽晒鈽?biāo)記物2-AB進(jìn)行標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)對(duì)不同的標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了比較，所得色譜圖見(jiàn)圖1B。不同標(biāo)記時(shí)間的色譜圖，色譜峰的個(gè)數(shù)、保留時(shí)間基本一致，并且隨著標(biāo)記時(shí)間的延長(zhǎng)，各色譜峰的峰高和峰面積均不同程度增加。但對(duì)各色譜峰峰面積所占比例的分析發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記4 h以后，28 min以后各峰峰面積所占比例開(kāi)始下降，即富含唾液酸的色譜峰面積所占比例下降。這可能是由于2-AB反應(yīng)是在酸性加熱條件下進(jìn)行，且隨標(biāo)記時(shí)間的延長(zhǎng)而脫唾液酸現(xiàn)象加劇。本實(shí)驗(yàn)選擇熒光標(biāo)記4 h。

2.1.3進(jìn)樣濃度的選擇實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了進(jìn)樣濃度對(duì)N-糖鏈液相色譜檢測(cè)的影響。通過(guò)與不同濃度乙腈混合，使得熒光標(biāo)記N-糖鏈的乙腈進(jìn)樣終濃度分別為20%、40%、60%和80%。從圖1C可見(jiàn)，使用20%和40%的乙腈濃度進(jìn)樣，樣品色譜圖的基線具有明顯的波動(dòng)和漂移，各色譜峰前延，影響檢測(cè)效果。60%的乙腈濃度進(jìn)樣條件下，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰對(duì)稱，并且無(wú)任何色譜峰丟失情況。而使用80%的乙腈濃度進(jìn)樣，保留時(shí)間在28 min以后的色譜峰峰高顯著降低，甚至完全消失。后續(xù)N-糖鏈結(jié)構(gòu)分析結(jié)果提示這些色譜峰中含有大量末端唾液酸修飾的酸性N-糖鏈。高乙腈進(jìn)樣濃度對(duì)液相色譜檢測(cè)的影響，可能是由于末端具有唾液酸修飾的酸性N-糖鏈在此條件下溶解度較小，隨著離心過(guò)程中析出，最終導(dǎo)致樣品檢測(cè)中28 min以后的N-糖鏈的色譜峰丟失。而保留時(shí)間28 min以前色譜峰未見(jiàn)明顯改變，可以推測(cè)乙腈進(jìn)樣濃度對(duì)聚合度較低的中性糖影響較小，這也與以往對(duì)植物N-糖組的研究所觀察到的現(xiàn)象類似，由于植物N-糖鏈缺乏唾液酸修飾，因此80%的乙腈進(jìn)樣濃度對(duì)植物N-糖組的檢測(cè)并無(wú)明顯影響[13]。綜合考慮本實(shí)驗(yàn)選擇60%作為優(yōu)化的乙腈進(jìn)樣濃度。

圖1 不同優(yōu)化方法處理人血漿所得蛋白結(jié)合N-糖鏈的UPLC譜圖比較Fig.1 Comparison of chromatograms of N-glycans on glycoproteins from human plasma under different procedures(A) Pretreatment;(B) Labeling time;(C) Acetonitrile concentration.

最后確定的分析方法為：對(duì)血漿樣品進(jìn)行直接加熱法前處理、PNGase F釋放糖鏈，經(jīng)固相萃取柱純化后采用2-AB進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記時(shí)間4 h，標(biāo)記產(chǎn)物使用60%乙腈濃度進(jìn)樣，UPLC法檢測(cè)。

2.2 人血漿N-糖鏈UPLC檢測(cè)和結(jié)構(gòu)分析

圖2 人血漿N-糖鏈UPLC譜圖及唾液酸酶消化后的N-糖鏈UPLC譜圖Fig.2 UPLC profile of human plasma N-glycans and product of sialidase digestion

2.2.1人血漿N-糖鏈UPLC檢測(cè)和唾液酸酶消化分析人血漿N-糖鏈色譜圖如圖2所示。共檢測(cè)到色譜峰19個(gè)，其保留時(shí)間和相對(duì)含量分別為20.8 min(2.49%)、21.7 min(0.92%)、22.1 min(0.35%)、23.6 min(2.89%)、24.1 min(1.59%)、25.0 min(1.77%)、25.4 min(1.03%)、26.7 min(4.66%)、27.5 min(0.53%)、28.2 min(15.94%)、29.4 min(7.66%)、30.6 min(40.48%)、31.6 min(3.96%)、32.1 min(1.58%)、32.4 min(1.03%)、33.5 min(3.64%)、34.3 min(4.20%)、35.6 min(4.83%)、36.2 min(0.45%)。經(jīng)過(guò)唾液酸酶處理去除末端唾液酸修飾后，血漿樣品中N-糖鏈的譜圖發(fā)生了明顯改變：保留時(shí)間為28.2、30.6、32.1、32.4、34.3、35.6 min的譜峰響應(yīng)值發(fā)生了明顯的降低，而25.4、26.7、27.5 min 的譜峰響應(yīng)值升高。推斷28 min后的絕大部分色譜峰所含N-糖鏈均具有末端唾液酸修飾。而酶處理后，保留時(shí)間為25.8、26.7、27.5 min的色譜峰響應(yīng)值增高，可能是由于唾液酸酶的消化作用使得相應(yīng)無(wú)唾液酸N-糖結(jié)構(gòu)的含量上升。

2.2.2人血漿N-糖鏈的葡萄糖單位值計(jì)算為了進(jìn)一步分析人血漿中N-糖鏈的結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜分離所得各色譜峰的葡萄糖單位(GU)進(jìn)行了計(jì)算，通過(guò)與已有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較和質(zhì)譜分析結(jié)果互相驗(yàn)證，從而推測(cè)各峰所含N-糖鏈的可能結(jié)構(gòu)。在對(duì)人血漿樣品進(jìn)行UPLC檢測(cè)的同時(shí)檢測(cè)2-AB標(biāo)記的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(聚合度2～20)。根據(jù)UPLC譜圖中不同聚合度的葡聚糖的保留時(shí)間，計(jì)算人血漿樣所含19個(gè)峰的GU值分別為5.93、6.11、6.28、6.65、6.85、6.99、7.14、7.48、7.67、7.95、8.22、8.60、8.83、9.11、9.17、9.52、9.98、10.19和10.47。使用GU值為各峰命名，并依據(jù)圖中標(biāo)示進(jìn)行收集，旋干后使用MALDI-TOF MS對(duì)各峰進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.3人血漿N-糖鏈的質(zhì)譜分析根據(jù)正離子模式下各色譜峰的一級(jí)質(zhì)譜圖，共檢測(cè)到11個(gè)[M+Na]+離子峰符合2-AB標(biāo)記N-糖鏈的理論荷質(zhì)比，分別為：m/z1606.25、m/z1377.59、m/z1808.76、m/z1767.98、m/z1767.76、m/z1539.66和m/z1970.91、m/z1783.76、m/z1929.55、m/z2132.65和m/z2025.77。與檢測(cè)到的[M+Na]+離子峰對(duì)應(yīng)的N-糖鏈具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。

根據(jù)負(fù)離子模式下各色譜峰的一級(jí)質(zhì)譜圖，共檢測(cè)到29個(gè)離子峰符合2-AB標(biāo)記N-糖鏈的理論荷質(zhì)比。其中25個(gè)[M-H]-離子峰分別為：m/z1888.88、m/z1847.56、2033.63和2050.63、m/z2032.80以及2237.89、m/z2050.74、m/z2197.11、m/z2341.88和2399.95、m/z2196.92、2416.00和2488.02、m/z2562.14 和2691.32、m/z2416.16、2475.14和2562.21、m/z2474.94、2562.10和2707.15、m/z2999.03、m/z2781.20和m/z2839.38、2927.39。另外還檢測(cè)到m/z2766.00的[M+Na+K-3H]-離子峰，m/z3036.18 和3182.29的[M+K-2H]-離子峰，以及m/z3400.49的[M+K-2H]-離子峰。與檢測(cè)到的離子峰相對(duì)應(yīng)的N-糖鏈具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。

此外還檢測(cè)到m/z2050.79的[M-H]-離子峰，可能為N-糖鏈2-AB-A2G2S(3)2在質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中脫去一個(gè)唾液酸導(dǎo)致。檢測(cè)到m/z2416.03[M-H]-的值，符合2AB-Hex6HexNAc5Neu5Ac(m/z2415.88[M-H]-)的理論值，但與2-AB-A3G3S(3)和2-AB-A3G3S(6)的GU值均不相符，可能為色譜峰9.17的污染。檢測(cè)到m/z2707.33 [M-H]-的值，符合2AB-Hex6HexNAc5Neu5Ac2(m/z2706.98[M-H]-)的理論質(zhì)荷比，但與2-AB-A3G3S(3)2的GU值不符，可能為色譜峰9.52的污染。檢測(cè)到m/z2416.11 [M-H]-(2-AB-A3G3S)的值,可能為N-糖鏈2-AB-A3G3S(3)2在質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中脫去一個(gè)唾液酸所得。檢測(cè)到m/z2475.81的值，與2AB-Hex6HexNAc6Fuc(m/z2473.92 [M-H]-)的理論質(zhì)荷比相似，但其GU值不符合2-AB修飾的N-糖鏈2-AB-A4G3F和2-AB-FA4G3，可能是2-AB-FA4G3S在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)脫唾液酸的產(chǎn)物。

根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、GU值及已知N-糖鏈數(shù)據(jù)，共推測(cè)出人血漿中N-糖鏈結(jié)構(gòu)40種，見(jiàn)表1。其中包含高甘露糖型的N-糖鏈3種(M5、M6和M9)，雜合型N-糖鏈1種(M4A1G1S)，其余均為復(fù)雜型N-糖鏈。復(fù)雜型N-糖鏈中二天線型共19種，三天線型12種，四天線型5種，具有核心α1，6巖藻糖修飾的共20種，具有中分型乙酰氨基葡萄糖修飾的6種，具有末端唾液酸修飾的26種。根據(jù)帶電荷的情況，共檢出中性N-糖鏈13種，主要分布在保留時(shí)間28 min以前，酸性N-糖鏈即具有唾液酸修飾的N-糖鏈共有27個(gè)，主要分布在保留時(shí)間25 min以后，尤其是保留時(shí)間30 min以后的大部分N-糖鏈都具有至少兩個(gè)唾液酸修飾。由此可見(jiàn)，根據(jù)GU值和質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析的糖鏈結(jié)構(gòu)與之前唾液酸酶消化的結(jié)果相一致。文獻(xiàn)報(bào)道[14 - 15]通過(guò)此方法檢測(cè)到人血漿中的N-糖鏈結(jié)構(gòu)種類與相對(duì)含量與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[4]。人血漿蛋白結(jié)合N-糖鏈主要以復(fù)雜型N-糖鏈為主，此外還含有微量的高甘露糖型和雜合型糖鏈。復(fù)雜型N-糖鏈種類包括二天線、三天線、四天線復(fù)雜型N-糖鏈，其中二天線型N-糖鏈占總糖鏈的30%以上。復(fù)雜型N-糖鏈常具有核心α1，6巖藻糖修飾和/或末端唾液酸修飾和/或中分型乙酰氨基葡萄糖修飾，其中大部分復(fù)雜型N-糖鏈都含有末端唾液酸修飾。

表1 根據(jù)UPLC和MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)推測(cè)的人血漿蛋白結(jié)合N-糖鏈

Note:A:GlcNAc;B:Bisecting GlcNAc;G:galactose;M:maltose;F:fucose;S(3):α2,3 sialic acid;S(6):α2,6 sialic acid.

2.3 血漿樣品蛋白結(jié)合N-糖鏈分析方法的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證血漿樣品蛋白結(jié)合N-糖鏈分析方法，分別對(duì)樣品檢測(cè)限和重復(fù)性進(jìn)行了考察。由圖3A所示，比較血漿用量從1.25 μL到200 μL的檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)色譜圖，當(dāng)血漿用量為200 μL時(shí)，色譜峰8.60超出了儀器的檢測(cè)上限；而1.25 μL的樣品除色譜峰7.95和8.60以外，其余色譜峰的峰高均不足基線噪音的3倍，因此該方法的檢測(cè)限為2.5 μL血漿用量。當(dāng)血漿用量5 μL時(shí)，各峰峰高均達(dá)到基線噪音的10倍以上，因此該方法定量限為5 μL血漿用量。為了驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性及重復(fù)性，采取連續(xù)3 d每天重復(fù)3次檢測(cè)同一血漿樣品，根據(jù)圖3B顯示，9個(gè)樣品各色譜峰的峰面積占比無(wú)顯著性差異，表明該N-糖鏈分析方法在時(shí)間、儀器誤差允許的前提下，具有較好的穩(wěn)定性以及重復(fù)性，為后期大規(guī)模微量樣本的測(cè)定提供了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

以往研究表明人血漿中富含唾液酸修飾的N-糖鏈，而唾液酸化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，尤其是在酸堿溶液中，高溫處理會(huì)引起唾液酸結(jié)構(gòu)的破壞[16]。本研究結(jié)合UPLC法、外切糖苷酶分析和離線MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)前處理方法、糖鏈熒光標(biāo)記和液相色譜進(jìn)樣濃度是影響富含唾液酸修飾N-糖鏈檢測(cè)的關(guān)鍵步驟，并進(jìn)行了相應(yīng)優(yōu)化。此外實(shí)驗(yàn)還考察了優(yōu)化后方法的檢測(cè)限和重復(fù)性，證明其適合于微量人血漿樣品的蛋白結(jié)合N-糖鏈分析檢測(cè)。方法樣品處理簡(jiǎn)便，重復(fù)性高，并能在現(xiàn)有條件下最高限度地保證血漿樣品中含唾液酸N-糖鏈的完整性。