環(huán)境DNA技術在魚類資源研究中的應用

郝雅賓 張愛菊 劉金殿 顧志敏

（浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室 浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室 中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所浙江研究中心，湖州 313001）

魚類資源下滑、匱乏或者小型化是當今漁業(yè)資源面臨的重大問題之一，究其原因主要有過度捕撈、水污染、棲息地退化、遺傳污染、氣候變化和入侵物種引進等［1-3］，這些因素使得魚類資源保護具有挑戰(zhàn)性。水生態(tài)系統(tǒng)構成復雜多樣，某些魚類因個體小、數(shù)量少、善隱蔽等因素難以被捕獲，且處于不同生長發(fā)育階段形態(tài)上差異較大，極難鑒定，這使得魚類資源調查極為困難。傳統(tǒng)的調查主要利用拖網(wǎng)、圍網(wǎng)、電捕魚、釣魚、水聲和視覺等方法［4］來觀察魚類，不僅耗時費力、價格不菲，而且有的方法會對魚體造成傷害［5］，同時還可能會由于采樣方式的缺陷導致數(shù)據(jù)不全面、不可靠。環(huán)境DNA（eDNA）是最近開發(fā)的一種高靈敏、高效率且無損傷的調查工具［6］，能夠為解決魚類資源研究過程中存在的難題提供高效快捷的方法，且已經(jīng)達到了成熟的科學水平［7-9］。eDNA是指從生物體生活環(huán)境中直接提取到的DNA片段總和，由不同物種的DNA混合而成，主要包含生物體細胞釋放到水中的胞內遺傳物質和細胞結構裂解或死亡后釋放到水中的胞外DNA［10-11］。eDNA技術是指從環(huán)境樣品中直接提取DNA片段，應用分子手段檢測eDNA中所包含識別片段，結合目標物種或種群的特異性基因識別片段進行比對的一種手段，其結果可用于分析目標生物在生態(tài)系統(tǒng)中的分布特征。近幾年來，eDNA技術在魚類種類及多樣性監(jiān)測［12-15］、資源量估測［16-17］和種群分布［18］等方面都有一定的發(fā)展和應用。隨著魚類資源的深入研究，分子技術與傳統(tǒng)的調查方法相結合的方式將成為未來該領域研究的一個發(fā)展趨勢。本文主要對環(huán)境DNA技術在魚類資源研究中的應用進行了綜述，旨為下一步開展魚類物種多樣性、資源量估算和種群分布等研究提供參考。

1 環(huán)境DNA技術的研究方法

1.1 樣品采集

依據(jù)選取的eDNA分析方法有必要選擇合適的水樣采集方式。一般的，使用采水器在不同深度的水位采集不同的水樣，采水器等設備和儲存容器應無菌處理，以避免來自除取樣水體之外的其他來源的目標DNA污染樣品。采集的水樣體積在15 mL-10 L不等（表1），而最常用的水樣體積為1 L-2 L，且同一水體中需采集多個重復樣品［19-20］。通過多次取樣的方法以增加水樣中的物種空間覆蓋度，提高物種檢出概率［10］。研究表明，水體沉積物中的eDNA比水體中的更加集中［21］，有時為了提高檢出概率，可選擇采集水域中的底泥沉積物。

1.2 樣品DNA提取

通常水體中eDNA主要有離心沉淀和真空過濾兩種方法來分離（表1）。水樣采集后，應保持樣品冷卻［31］，并盡量減少暴露于光下［32］，且在24 h內進行過濾或沉淀［20］，以減少DNA降解，降低物種檢出率。過濾主要是通過濾膜來進行的，濾膜的孔徑大小不一，有 0.22 μm-1.5 μm、0.2 μm-10 μm［33］和 0.45 μm-3 μm［10］不等?？讖皆叫?，eDNA 提取的量越大，但孔徑小易堵塞濾膜，影響過濾速度［33］。一般使用2.5倍體積的無水乙醇或者0.6倍體積的異丙醇沉淀eDNA［34］，也可通過離心的方法。eDNA可通過多種方法從過濾或沉淀物中提取，可利用氯仿［35-36］和二氧化硅萃取［37］，或細胞的物理裂解［14，22］，DNA 快速提取試劑盒［38-39］等提取。

表1 環(huán)境DNA樣品的采集和處理

1.3 eDNA分析

研究表明，水樣中的大部分eDNA可能是包含在線粒體或游離的細胞內的DNA，而不是游離DNA［33］。由于線粒體DNA拷貝數(shù)大、區(qū)分物種的保守序列較多，常優(yōu)先于核DNA進行eDNA分析，以提高檢測概率。與核DNA比較而言，線粒體DNA很大程度上避免了環(huán)境中的DNA易降解和濃度低等因素造成的不易檢測問題［10］。

eDNA分析通?；趲в形锓N特異性遺傳標記序列的線粒體DNA片段（80-250 bp）進行高通量測序［5］，克隆測序分析時可以超出這個范圍。eDNA用于研究魚類資源方面，假如只調查研究某一種魚類時，則只需針對該種設計特異性高的引物，確保目標物種的高靶特異性，沒有堿基對錯配，以及任何緊密相關或共存物種盡可能多的錯配［24］。假如研究一魚類群體時，則需要設計通用引物，主要包含 16s、COI、Cytb1、Cytb4 和 D-loop 等［40］， 使 環(huán)境中魚類群體的eDNA擴增的識別片段足夠多，還需建立目標（A）與非目標（B）基因庫，將擴增B超過A設定值的引物剔除，以得到具足夠通用性且一定特異性的通用引物［41］。利用特異性引物進行PCR擴增，擴增的片段幾十到幾百bp不等（表2），獲得DNA識別片段，測序后可得到該片段的序列。PCR結果進行凝膠電泳，顯示正確長度的獨特PCR凝膠條帶為陽性檢測結果，陽性結果表明eDNA樣品中包含目標物種的DNA，代表取樣水域中有該魚類生存；陰性結果說明不含有來自目標物種的DNA，代表取樣水域中沒有目標魚類或者取樣量不足于檢測到。為了確認陽性檢測結果，至少重復兩次試驗［25，42］。為避免影響試驗結果，應在DNA樣品采集、提取和擴增的試驗過程中設置陰性對照組以避免交叉污染［22，39］。

表2 運用環(huán)境DNA檢測魚類情況

2 環(huán)境DNA技術在魚類資源研究中的應用

2.1 種類和物種多樣性研究

國內外運用eDNA技術監(jiān)測魚類種類和物種多樣性調查方面報道不少（表3）。主要包含瀕危種、稀有種和入侵種的監(jiān)測。常見魚類是水域中魚類群落的組成，應用eDNA了解其資源狀況，有利于保護和開發(fā)魚類資源，有利于當?shù)氐臐O業(yè)增殖放流工作，有利于水生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。而瀕?；蛳∮恤~類由于自身或人為或自然等因素導致其野生種群易面臨絕滅的危險。一個關鍵種的滅絕可能破壞水生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈，造成水生態(tài)系統(tǒng)的不穩(wěn)定。瀕?；蛳∮恤~類不易捕獲且生物量少，而eDNA技術可在生物量較小的情況下進行檢測，對其監(jiān)測具有重要意義。入侵魚類易造成生物多樣性喪失，早發(fā)現(xiàn)早處理是應對生物入侵的關鍵環(huán)節(jié)［44］。而在入侵前期，入侵種生物量較小，未形成種群，易低估入侵程度。因此，應用eDNA技術對入侵種進行早期檢測，可為生物入侵預防工作提供支持。很大程度上，水體中提取到的DNA量影響著水生系統(tǒng)中的生物多樣性檢測［45］。

表3 江河湖泊海域中運用環(huán)境DNA檢出的魚類

2.2 資源量估算

在漁業(yè)資源評估上，資源量基于傳統(tǒng)方法采樣很難進行準確估計的［10］，而對于那些處于受威脅和瀕危物種來說，準確和精確的資源量估計顯得至關重要［50］，這對于保護和挽救工作具有重要意義。水聲學可以估算一個水域中魚類的平均密度，但也很難得到準確和精確的數(shù)據(jù)。因此，eDNA濃度與資源量之間的關系是一個相當大的研究課題，但也存在eDNA技術對資源監(jiān)測的準確性如何保證的問題。近年來研究表明，可以從eDNA在水樣中的豐度來估計魚類的相對資源量，并發(fā)現(xiàn)資源量與eDNA濃度之間存在正相關關系［16，27］，盧珊［51］發(fā)現(xiàn) eDNA與相應的水生動物間存在密切的關系，但這種關系可能不適用于所有物種和環(huán)境條件［52］?？梢?，模擬實驗可了解某個種類的豐度與eDNA濃度的關系，從而推測其資源量與eDNA濃度的關系方程。由此，對某個自然水域中的eDNA進行采樣分析，監(jiān)測某個種類的eDNA濃度，據(jù)模擬實驗所得的方程來推測其在某個自然水域中的資源量。由于eDNA的來源，脫落率，降解速率，轉運和沉降等因素，這些因素都會影響eDNA的提取，從而不表現(xiàn)出這種關系［53］。也就是說，eDNA在水體中存在具有實時性，易影響與魚類資源量的生物關系。除此之外，在樣品處理期間錯誤引用也可能會導致數(shù)量關系的分離。運用eDNA研究魚類生物量時要注意近緣物種干擾、魚類的活動周期以及水流速度方向等問題。在今后的一段時間內，資源量和eDNA濃度之間的關系可能是一個熱點的研究領域。

2.3 種群分布

傳統(tǒng)的研究方法很難精確的劃分魚類種群的分布范圍，而eDNA技術不受條件的限制，具靈敏度高、無損傷性的特點，只需采集水體樣本獲得DNA即可分析魚類的存在。運用eDNA技術來分析魚類入侵種和瀕危種種群分布的報道不少，美國密歇根湖及其周邊河流中的鰱（H.molitrix）和鳙（H.nobilis）的擴散分布范圍已經(jīng)超出了傳統(tǒng)調查方法研究劃定的區(qū)域［22］，這對入侵種的防治工作具有提示作用［25］。Takahara等［25］分析了藍鰓太陽魚（L.macrochirus）在日本本土及周邊島嶼水域的擴散分布趨勢情況。歐洲泥鰍（Misgurnus fossilis）不僅在丹麥現(xiàn)有分布區(qū)有分布，且在以前調查發(fā)現(xiàn)的分布區(qū)中也有其的分布蹤跡［54］。另外，入侵種克氏原鰲蝦（Procambarus clarkii）在梯田中分布情況也有報道［55］?？梢?，在種群分布確定方面，eDNA技術優(yōu)于傳統(tǒng)的調查方法，其發(fā)展和應用將有助于本地種的監(jiān)測，也有助于對入侵種和瀕危種部分范圍進行監(jiān)測。

2.4 食性分析與“三場一通道”監(jiān)測

eDNA技術可運用于魚類的食性分析，近年來，eDNA也開始應用于動物食性的研究，但魚類食性分析的鮮有報道。食性分析的傳統(tǒng)方法主要有消化殘留物觀察法和腸道解剖法，它們都存在著局限性，依賴于觀察者對腸道內未消化物和消化殘留物的準確判斷，對于生活在水下的微小型魚類難以通過視覺觀察來了解。eDNA技術在動植物［56-57］、浮游生物［51］、蝦類［51，55］和魚類等［22-25］監(jiān)測都有應用的報道。因此，在食性分析時，對水生植物、浮游生物及其餌料魚類都可以應用eDNA進行監(jiān)測，可作為一種便捷的檢測方法；而肉食性魚類與作為餌料魚類可通過設計特異性引物加以區(qū)分開來。可見，可以應用eDNA的方法來監(jiān)測魚類腸道中餌料生物的種類，且具有無限潛力，再結合傳統(tǒng)方法，或許在全面了解魚類食性方面可取得巨大的進展。

目前，應用eDNA技術對定居性魚類的產(chǎn)卵場和洄游性魚類“三場一通道”監(jiān)測工作鮮有報道，魚類的“三場一通道”主要是指魚類產(chǎn)卵場、索餌場、越冬場和洄游通道，是魚類棲息生活生存的重要場所。漁業(yè)資源調查工作者可在魚類種群分布探究的基礎上，eDNA技術結合傳統(tǒng)的調查方法可否更快捷有效的對定居性魚類種群產(chǎn)卵場和對洄游性魚類“三場一通道”進行監(jiān)測，傳統(tǒng)方法的耗費人力物力和時間較大，應用eDNA技術監(jiān)測“三場一通道”將是今后漁業(yè)資源工作者值得探索的方向。

3 展望

與基于捕獲的方法相比，eDNA技術具有高靈敏、無損傷、低成本、快捷方便等特點，在魚類種類監(jiān)測、魚類多樣性監(jiān)測、資源量估測和種群分布等方面已得到應用，而將來是否可應用于食性分析與“三場一通道”監(jiān)測的工作中值得探討。但目前eDNA技術還存在不足之處，如不能提供魚類的生理狀態(tài)、生長發(fā)育階段等生物學特征以及魚類的種群結構；不能提供魚類目標種存在或不存在的實時數(shù)據(jù)；環(huán)境中保存的線粒體eDNA不能在將“純種”與雜交種區(qū)分開來。雖然存在這些缺點，但將eDNA技術作為一種魚類資源調查評估的工具未免不可，結合傳統(tǒng)的采樣方法，如電動捕撈、網(wǎng)捕、水聲調查等，可以有效的摸清魚類資源狀況，但eDNA技術還不能完全取代經(jīng)過時間驗證的魚類資源評估方法。