MEKK3在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)和臨床價(jià)值

黃海鵬， 付偉金， 韋康來， 徐小龍， 陳文元

腎癌是最常見的腎臟惡性腫瘤，約占腎臟惡性腫瘤的80%，而腎癌中約80%為腎透明細(xì)胞癌(clear renal cell carcinoma, CRCC)[1]。目前臨床上關(guān)于CRCC的治療雖然取得了一定的成效，但仍缺乏對(duì)CRCC所涉及的分子和細(xì)胞機(jī)制的研究[2]。有研究認(rèn)為，有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase kinase 3, MEKK3)可能與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。研究表明，MEKK3在CRCC患者中過表達(dá)，提示MEKK3在多種惡性腫瘤包括CRCC的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用[3-4]。為探討MEKK3的表達(dá)情況與CRCC的關(guān)系，本研究擬檢測CRCC組織中MEKK3的表達(dá)，探討其與CRCC的臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 收集2010年1月1日-2016年12月31日實(shí)行根治性腎切除術(shù)的標(biāo)本70例，男性43例，女性27例；年齡中位數(shù)58歲(34～79歲)。腫瘤部位：左側(cè)34例，右側(cè)36例。根據(jù)2010年AJCC推薦的TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行分期，其中Ⅰ期18例，Ⅱ期25例，Ⅲ期19例，Ⅳ期8例。患者均經(jīng)病理確診為CRCC，術(shù)前均未接受化療或放療。同時(shí)取30例癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣≥2 cm)為對(duì)照組，男性19例，女性11例；年齡中位數(shù)57歲(42～68歲)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色 取腎癌組織及癌旁正常腎組織各0.2 g，平均分成2份，一份迅速置于-80 ℃低溫冰箱保存，提取蛋白行免疫印跡檢測；另一份置于10%中性甲醛中固定，行免疫組織化學(xué)檢測。所有組織均經(jīng)10%中性甲醛緩沖液固定，常規(guī)脫水、浸蠟，石蠟包埋，切片厚度4 μm。采用SP法，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照染色。一抗為MEKK3(美國Abcam公司)，稀釋為1∶50，二抗為快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，均購于福建邁新生物技術(shù)有限公司，二甲苯脫蠟，乙醇脫苯，3%的過氧化氫脫內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸高壓修復(fù)法修復(fù)，一抗4 ℃冰箱過夜，二抗37%水浴25 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片。

1.2.2免疫印跡法檢測MEKK3表達(dá) 組織塊稱質(zhì)量后，于液氮中研缽粉碎，洗滌離心后取上清。Bradford法檢測樣品中的蛋白濃度，15%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，兔抗人MEKK3單克隆抗體(美國Abcam公司)孵育過夜，二抗孵育，顯色后進(jìn)行圖像分析。從CRCC組織和癌旁正常腎組織各提取4例進(jìn)行免疫印跡檢測。

1.2.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 由2個(gè)病理科醫(yī)師獨(dú)立雙盲評(píng)價(jià)MEKK3的表達(dá)，根據(jù)染色指數(shù)評(píng)價(jià)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，染色指數(shù)為染色陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞染色強(qiáng)度的乘積：(1)染色陽性細(xì)胞數(shù)。0(0%～1%)，1(>1%～10%)，2(>10%～50%)，3(>50%～75%)，4(>75%～100%)；(2)細(xì)胞染色強(qiáng)度。無染色為0分，弱陽性(淺黃色)為1分，陽性(棕黃色)為2分，強(qiáng)陽性(棕褐色)為3分。MEKK3在CRCC中的表達(dá)通過染色指數(shù)衡量，≥6分表示MEKK3高表達(dá)，<6分則表示MEKK3低表達(dá)[3]。

1.2.4隨訪情況 所有患者均進(jìn)行隨訪，中位隨訪時(shí)間為62月(13～88月)，總生存期(overall survival, OS)為手術(shù)日期到隨訪結(jié)束，或是因腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用軟件X-tile篩選MEKK3免疫組織化學(xué)正常表達(dá)和過表達(dá)的分界值。MEKK3與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性應(yīng)用卡方檢驗(yàn)。對(duì)生存數(shù)據(jù)采用Kaplan-Meier分析并繪制生存曲線，應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)差異性，預(yù)后因素分析采用Cox回歸模型。2組計(jì)量資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料比較采用方差分析。P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MEKK3蛋白在CRCC組織和癌旁正常組織中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，MEKK3主要表達(dá)于胞質(zhì)和胞膜。70例CRCC組織中，MEKK3蛋白陽性表達(dá)50例(71.4%)；30例癌旁正常腎組織中，MEKK3蛋白陽性表達(dá)6例(20%)，二者比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。免疫印跡結(jié)果顯示，CRCC組織中MEKK3蛋白的表達(dá)水平高于癌旁正常腎組織，組間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

2.2MEKK3與臨床參數(shù)的關(guān)系 卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，MEKK3表達(dá)與性別(P=0.027)、年齡(P=0.007)、腫瘤大小(P=0.004)有關(guān)(表1)。

2.3CRCC患者中MEKK3的表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性 Kaplan-Meier法結(jié)果提示，MEKK3蛋白高表達(dá)患者(平均生存期為56月)預(yù)后明顯低于低表達(dá)者(平均生存期為70月)(圖3)。單因素Cox回歸分析提示，年齡、腫瘤大小、TNM分期、MEKK3表達(dá)水平與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)；多因素Cox回歸分析顯示，年齡、腫瘤大小、TNM分期、MEKK3表達(dá)水平是判定CRCC預(yù)后的獨(dú)立因素(表2)。

3 討 論

CRCC是腎惡性腫瘤最常見的病理類型，早期患者可通過腎癌根治術(shù)獲得治愈，而晚期患者對(duì)化療及放療均不敏感，預(yù)后不佳[5-7]。靶向治療目前已成為治療晚期患者的主要手段[8]，短期客觀緩解率可達(dá)40%～50%，但長期緩解率低。因此，早期診斷和準(zhǔn)確的預(yù)后評(píng)估對(duì)CRCC的診治具有重要意義，但CRCC的發(fā)生機(jī)制目前還不清楚。

A，B為MEKK3蛋白在CRCC組織中高表達(dá)(SP ×100，200)；C，D為MEKK3蛋白在CRCC組織中表達(dá)(SP ×100，200；E，F(xiàn)為MEKK3蛋白在癌旁正常腎組織中低表達(dá)(SP ×100，200).圖1 免疫組織化學(xué)檢測MEKK3在CRCC組織與癌旁正常腎組織中的表達(dá)Fig 1 Immunohistochemical detection of MEKK3 in CRCC tissue and adjacent normal renal tissue

T為CRCC組織；N為癌旁正常腎組織.圖2 免疫印跡檢測MEKK3在CRCC組織與癌旁正常腎組織中的表達(dá)Fig 2 The expression of MEKK3 in the normal renal tissue of CRCC tissue and carcinoma

圖3 MEKK3表達(dá)與生存曲線的關(guān)系Fig 3 The relationship between MEKK3 expression and survival curve

表1MEKK3表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者臨床參數(shù)的關(guān)系

Tab1The relationship between MEKK3 expression and clinicopathologic features of renal clear cell carcinoma

臨床參數(shù)nMEKK3的表達(dá)高表達(dá)(n=32)低表達(dá)(n=38)χ2P性別4.9170.027 男452520 女25718年齡/歲7.3890.007 ≤60452619 >6025619腫瘤大小/cm8.2890.004 ≤7352213 >7351025淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1.7890.181 N0592930 N1-21138TNM分期0.4380.508 Ⅰ～Ⅱ432122 Ⅲ～Ⅳ271116

表2腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的單因素與多因素分析

Tab2Single factor and multivariate analysis of prognosis in patients with renal clear cell carcinoma

臨床參數(shù)單因素分析HR(95% CI)P多因素分析HR(95% CI)P性別0.109 男,女1.43(1.230,1.880)年齡/歲0.0010.003 ≤60 >600.355(0.186,0.680)0.154(0.045,0.522)腫瘤大小/cm0.0190.031 >7 ≤71.478(1.258,1.884)2.824(1.099,7.258)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.273 N1-2 ,N00.649(0.299,1.406)TNM分期0.036<0.001 T3-4,T1-21.947(1.046,3.626)36.527(13.176,101.260)MEKK3表達(dá)0.0060.030 高,低2.408(1.291,4.490)2.128(1.076,4.208)

遺傳與基因變異可激活相關(guān)腫瘤信號(hào)通路，與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[9-10]。MEK/ERK信號(hào)通路可被相關(guān)生長因子或原癌基因突變后激活，參與調(diào)控包括CRCC在內(nèi)的多種癌細(xì)胞信號(hào)通路，而MEKK3是一種重要的蛋白激酶，可有效激活MEK/ERK信號(hào)通路，ERK磷酸化后可激活調(diào)控細(xì)胞增殖和生存的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子[11]。目前，關(guān)于MEKK3的表達(dá)與癌癥關(guān)系的研究中，劉平等研究顯示，宮頸上皮內(nèi)瘤變組織的MEKK3表達(dá)水平明顯高于慢性宮頸炎組織；劉健等研究顯示，MEKK3蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯高于前列腺增生組織[12-13]。國外研究也顯示，MEKK3在乳腺癌、宮頸癌等存在過表達(dá)[14-15]。本研究也顯示，MEKK3在CRCC組織中存在過表達(dá)，與Lu等和Qi等研究相一致[3-4]，提示MEKK3在CRCC的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果還顯示，MEKK3表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小有關(guān)，提示男性腎癌患者M(jìn)EKK3表達(dá)陽性率更高，可能有助于男性CRCC的篩查；≤60歲的CRCC患者M(jìn)EKK3表達(dá)陽性率更高，可能有助于相對(duì)年輕患者的篩查，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步分析。另外，Kaplan-Meier法結(jié)果顯示，MEKK3蛋白高表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)者；單因素Cox回歸分析提示，年齡、腫瘤大小、TNM分期、MEKK3表達(dá)水平與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)；多因素Cox回歸分析顯示，年齡、腫瘤大小、TNM分期、MEKK3表達(dá)水平是判定CRCC預(yù)后的獨(dú)立因素，提示相對(duì)于MEKK3蛋白低表達(dá)患者，高表達(dá)患者的預(yù)后更差，MEKK3蛋白表達(dá)是預(yù)后的獨(dú)立因素。Lu等利用RNA技術(shù)干擾腎癌細(xì)胞株中MEKK3蛋白后，引起腎癌細(xì)胞凋亡[3]，提示MEKK3過表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞凋亡失衡有關(guān)，抑制MEKK3蛋白有可能成為治療CRCC的新方法。

綜上所述，MEKK3的表達(dá)與CRCC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，提示MEKK3可能是MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要調(diào)節(jié)蛋白，與腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可能作為一個(gè)重要的CRCC預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物，靶向治療MEKK3可能為晚期CRCC治療提供新策略。另外，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并增加其他檢測指標(biāo)，以期為臨床診斷、治療CRCC提供更多、更可靠的依據(jù)。