LASS2在膀胱癌組織中的表達及對細胞增殖和侵襲能力的影響

袁 遠， 黃恩應(yīng)， 陳小剛

膀胱癌作為我國人群泌尿系統(tǒng)發(fā)病率較高且呈逐年升高趨勢的惡性腫瘤[1]，由于早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已是中晚期，且術(shù)后易復(fù)發(fā)，患者遠期治療效果及預(yù)后不佳[2]。研究表明，膀胱癌高浸潤和轉(zhuǎn)移性是導(dǎo)致患者死亡的主要因素[3]。隨著基因靶向治療技術(shù)的發(fā)展，為膀胱癌治療提供了新的方向[4]。人源性長壽保障基因2(longevity assurance homologue 2 of yeast LAG1，LASS2)作為一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的基因，參與了多種惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程[5]。動物實驗表明，LASS2具有抑制裸鼠膀胱癌模型腫瘤增殖的作用[6]。本研究利用免疫組織化學(xué)法分析膀胱癌組織中的LASS2蛋白表達，探討其與臨床病理指標的相關(guān)性，并觀察下調(diào)LASS2基因的表達對膀胱癌細胞增殖和侵襲能力的影響。

1 對象與方法

1.1對象 選取2014年3月-2017年4月?lián)衿谛惺中g(shù)治療的原發(fā)性膀胱癌初診患者93例，男性71例，女性22例，年齡(61.9±11.5)歲(31～79歲)?；颊咝g(shù)前均未接受放療或化療，術(shù)后均經(jīng)病理明確診斷為膀胱癌。根據(jù)2004年WHO分級標準：G1級30例、G2級29例、G3級34例；根據(jù)2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第六版TNM分期標準：淺表型63例、浸潤30例；腫瘤直徑≤3 cm者49例，>3 cm者44例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例。同期，選取行膀胱開放手術(shù)或膀胱鏡活檢并排除腫瘤的患者40例作為對照組，男性29例，女性11例，年齡(62.7±12.1)歲(32～78歲)。2組患者的性別、年齡差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意。

1.2方法

1.2.1主要試劑和設(shè)備 免疫組織化學(xué)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)；羊抗人LASS2多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)公司)；人膀胱癌BIU-87細胞(中科院上海生科院細胞資源中心)；胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogen公司)；四氮唑藍(MTT)(美國Biotrin公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；Martrigel基質(zhì)膠和凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(美國BD公司)。LASS2干擾序列和陰性對照序列由上海吉瑪制藥技術(shù)公司合成，LASS2和β-actin基因序列由上海生工生物公司設(shè)計合成。

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測膀胱癌組織和對照組的LASS2蛋白表達 取膀胱癌和對照組組織，甲醛固定、石蠟包埋、切片，厚度約4 μm，用烤箱80 ℃烤片60 min，脫蠟至水，用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液高溫抗原修復(fù)10 min，3%雙氧水室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，加入一抗羊抗人LASS2多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育60 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果判定：LASS2蛋白主要表達于細胞質(zhì)和細胞核，以出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒狀物質(zhì)為陽性。通過觀察染色強度和陽性細胞比例，采用半定量法評估結(jié)果[7]：(1)染色強度。未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；(2)陽性細胞比例。計數(shù)1 000個細胞，陽性細胞比例<5%，5%～25%，26%～50%，51%～75%和>75%，分別記為0，1，2，3，4分；(3)根據(jù)染色強度和陽性細胞比例評分的乘積，0～1分為陰性，≥2分為陽性。

1.2.3細胞培養(yǎng)和分組 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)BIU-87細胞，培養(yǎng)條件：37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2。待細胞融合度>85%時，胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化，按每孔2×104個細胞接種于6孔板，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書對細胞進行分組轉(zhuǎn)染：(1)LASS2干擾組：轉(zhuǎn)染LASS2基因的干擾序列為5′-CAGUAUUGGUACUACAUGATT-3′；(2)陰性對照組：轉(zhuǎn)染陰性對照序列為5′-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3′；(3)空白組：對細胞不作處理。轉(zhuǎn)染后用培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。

1.2.4Western-blot法檢測細胞中LASS2蛋白表達 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細胞，細胞裂解液裂解，按試劑盒說明書提取總蛋白，并檢測蛋白濃度和純度。取30 μg總蛋白，進行凝膠電泳分離，4 ℃下電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，將一抗羊抗人LASS2多克隆抗體按1∶1 200稀釋后加入，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入二抗，室溫孵育60 min，TBST洗滌3次，暗室條件下，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯色成像，采用Image J軟件對條帶進行分析，以GAPDH為內(nèi)參獲得細胞中的LASS2蛋白相對表達量。

1.2.5MTT法檢測細胞增殖 取各組細胞，胰蛋白酶進行消化后，將細胞濃度調(diào)整為2×105mL-1，各取100 μL加入96孔板，繼續(xù)用培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24，48，72和96 h時，向各孔加入MTT液(5 g/L)20 μL，37 ℃孵育2 h，棄上清，各孔加入二甲基亞砜200 μL，振蕩10 min，用酶標儀在470 nm處檢測各孔吸光度(A)值，作為細胞增殖活性。實驗重復(fù)3次。

1.2.6平板克隆形成實驗 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細胞，胰蛋白酶消化，取200個細胞接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，除去培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，甲醛固定20 min，用0.5%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下觀察，以≥50個細胞作為1個克隆，計數(shù)克隆形成數(shù)。

1.2.7Transwell小室檢測細胞侵襲能力 將Martrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)液稀釋后，平鋪于Transwell小室上室，在37 ℃恒溫箱中充分聚合。取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細胞，消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，濃度為1×106mL-1，取400 μL加入Transwell小室上室，將含10%胎牛血清的培養(yǎng)液500 μL加入下室，用培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件：37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2。將小室取出，棄培養(yǎng)液，甲醛固定，結(jié)晶紫染色25 min，用棉簽輕輕將散落細胞去除。用顯微鏡觀察，隨機取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1膀胱癌組織和對照組的LASS2蛋白表達 膀胱癌組織中LASS2蛋白的陽性率為40.86%(38/93)，對照組則為87.50%(35/40)，2組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=24.572，P<0.01，圖1)。

2.2膀胱癌組織中LASS2蛋白表達與臨床指標間的關(guān)系 膀胱癌組織中LASS2蛋白的陽性表達與性別、年齡、腫瘤直徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)，而與WHO分級和TNM分期有關(guān)(P<0.05，表1)?？瞻捉M、陰性對照組和LASS2干擾組細胞中LASS2蛋白相對表達量分別為(0.78±0.06)，(0.75±0.14)和(0.32±0.04)，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.777，P<0.01，圖2)。兩兩比較，空白組和陰性對照組細胞中LASS2蛋白相對表達量差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.559)，LASS2干擾組細胞中LASS2蛋白的相對表達量低于空白組和陰性對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3各組細胞增殖情況 空白組、陰性對照組和LASS2干擾組在24，48，72和96 h時細胞A值差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。兩兩比較，空白組和陰性對照組24，48，72和96 h時的細胞A值差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；LASS2干擾組24，48，72和96 h時的細胞A值均高于空白組和陰性對照組，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A：對照組，LASS2蛋白呈高表達，主要位于細胞質(zhì)和細胞核； B：低級別膀胱癌組織，LASS2蛋白呈中等強度表達； C：高級別膀胱癌組織，LASS2蛋白呈低表達.圖1 膀胱癌組織和對照組的LASS2蛋白表達(免疫組織化學(xué) ×400)Fig 1 Expressions of LASS2 proteins in bladder cancer tissue and control group (Immunohistochemistry ×400)

Tab1The relationship between the expression of LASS2 protein in bladder cancer tissues and clinicopathological parameters

指 標nLASS2蛋白陽性陰性性別 男7128(39.44)43(60.56) 女2210(45.45)12(54.55)年齡/歲 ≥623814(36.84)24(63.16) <625524(43.64)31(56.36)WHO分級☆ G1級3018(60.00)12(40.00) G2～G3級6320(31.75)43(38.25)TNM分期☆☆ 淺表型6332(50.79)31(49.21) 浸潤306(20.00)24(80.00)d腫瘤/cm ≤34917(34.69)32(65.31) >34421(47.73)23(52.27)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是124(33.33)8(66.67) 否8134(41.98)47(58.02)

表中數(shù)據(jù)為n(%). 膀胱癌組織中LASS2蛋白陽性表達與WHO分級和TNM分期有關(guān)，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

圖2 Western-blot法檢測各組細胞中LASS2蛋白表達Fig 2 Western-blot was usend to detect the expression of LASS2 protein in cells in each group

2.4各組細胞克隆形成情況 平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，空白組、陰性對照組和LASS2干擾組細胞克隆形成數(shù)分別為(26.01±1.84),(28.76±4.08)和(77.11±3.18)個，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=492.328，P<0.01，圖3)。兩兩比較，空白組和陰性對照組細胞的克隆形成數(shù)差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.154)；LASS2干擾組的細胞克隆形成數(shù)均高于空白組和陰性對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5各組細胞侵襲能力 空白組、陰性對照組和LASS2干擾組侵襲細胞數(shù)分別為(68.19±6.61),(74.66±7.64)和(124.02±12.29)個，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=66.303，P<0.01，圖4)。兩兩比較，空白組和陰性對照組的侵襲細胞數(shù)差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.241)；LASS2干擾組的侵襲細胞數(shù)均低于空白組和陰性對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組細胞增殖情況比較(吸光度A值)

n=6. 與LASS2干擾組比較，☆☆：P<0.05.

A：空白組，可見少量的細胞克隆形成； B：陰性對照組，可見少量的細胞克隆形成； C：LASS2干擾組，可見大量的細胞克隆形成.圖3 平板克隆形成實驗檢測各組細胞克隆形成情況Fig 3 Plate colony formation assay was used to detect the formation of colonies in each group

A：空白組，可見少量的穿膜細胞；B：陰性對照組，可見少量的穿膜細胞；C：LASS2干擾組，可見大量的穿膜細胞.圖4 Transwell小室檢測各組細胞侵襲能力Fig 4 Transwell chamber was used to detect the invasive ability of each group

3 討 論

膀胱癌包括非肌層浸潤性和肌層浸潤性2類，非肌層浸潤性約占75%以上，臨床治療后約有一半患者會復(fù)發(fā)，其中，約10%復(fù)發(fā)患者會進展為肌層浸潤性[8]。對于肌層浸潤性患者，臨床上以根治性膀胱切除為主，但30%～50%會因多發(fā)性轉(zhuǎn)移而死亡[9]。因此，積極探討影響膀胱癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因，對指導(dǎo)患者治療及改善預(yù)后意義重大。LASS2是與酵母長壽保障基因1具有高度同源性的人類基因，在神經(jīng)酰胺合成中發(fā)揮重要作用，與細胞周期、細胞生長及凋亡密切相關(guān)[10-11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲中發(fā)揮重要作用，被認為是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的候選基因[12]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中LASS2蛋白陽性率低于對照組，說明LASS2蛋白在膀胱癌組織中呈低表達，在與臨床病理指標之間的關(guān)系分析中發(fā)現(xiàn)，WHO分級G2～G3級和TNM分期淺表型患者膀胱癌組織中呈低表達，提示LASS2蛋白可能通過發(fā)揮抑癌基因的功能而參與了膀胱癌分化及浸潤過程。

有研究指出，LASS2參與了腫瘤組織的生長過程，上調(diào)其表達可減少腫瘤細胞增殖，加速細胞凋亡[13]。Fan等指出，AGPAT9可通過LASS2信號通路抑制乳腺癌細胞增殖[14]。本研究利用小分子RNA干擾技術(shù)，通過轉(zhuǎn)染LASS2抑制序列，獲得了低表達LASS2蛋白的膀胱癌細胞，MTT實驗和平板克隆形成實驗結(jié)果均顯示，下調(diào)LASS2基因表達組膀胱癌細胞增殖能力明顯增強，提示LASS2可能在抑制膀胱癌細胞增殖中發(fā)揮重要作用。有研究指出，LASS2可通過與液泡型ATPase質(zhì)子泵的c亞基相互作用而抑制質(zhì)子泵的跨膜轉(zhuǎn)運氫離子的功能，使胞外氫離子濃度減少，進而使對氫離子敏感的蛋白水解酶活性降低，減少了胞外基質(zhì)分解，從而抑制了細胞遷移和侵襲[15]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)LASS2基因可顯著增強膀胱癌侵襲能力，提示LASS2參與了膀胱癌細胞的侵襲過程，但具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述，LASS2蛋白在膀胱癌組織中呈低表達，且與膀胱癌的分化程度和浸潤有關(guān)，下調(diào)LASS2基因表達可促進膀胱癌細胞的增殖和侵襲，提示LASS2可能作為一種抑癌基因而參與了膀胱癌的發(fā)生及進展過程，有望為膀胱癌基因的靶向治療提供新的靶點，但具體作用機制有待進一步研究明確。