MC38-luc穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建及在小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中的應(yīng)用

林怡婷， 林雨虹， 阮 梅， 朱艷陽(yáng)， 張秋玉,2

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增加。2015年美國(guó)《臨床醫(yī)師癌癥雜志》公布的研究報(bào)告顯示，2000-2011年，我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率已躍居惡性腫瘤第5位[1]。肝臟是結(jié)腸癌最常見的轉(zhuǎn)移部位，肝轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者最主要的死因，肝轉(zhuǎn)移患者的平均生存期僅為4～7月[2-3]。有關(guān)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制尚不明確。既往用于研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型多采用免疫缺陷的小鼠進(jìn)行荷瘤。這些模型存在T或B細(xì)胞功能缺陷，無(wú)法用于分析轉(zhuǎn)移灶組織免疫微環(huán)境的改變及探討免疫治療措施的療效[4]。本研究首先構(gòu)建并篩選具有穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase, FLuc)的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞(MC38-luc)；其次，通過脾內(nèi)注射途徑建立小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，應(yīng)用小動(dòng)物活體成像技術(shù)實(shí)時(shí)觀察小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移過程。該研究結(jié)果將為后續(xù)深入探討結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的免疫學(xué)機(jī)制及免疫治療策略奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 6～8周齡雌性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～22 g[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002]，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物倫理審查號(hào)為2017-031。

1.1.2細(xì)胞系及試劑 MC38小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存細(xì)胞系；pGL4.50-luc2/CMV/Hygro質(zhì)粒及熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中量抽提試劑盒(北京天根生化技術(shù)研究所)；D-luciferin(美國(guó)Perkin Elmer公司)；RPMI 1640培養(yǎng)液及添加劑、LB培養(yǎng)基、潮霉素、氨芐青霉素和水合氯醛(美國(guó)Sigma公司)；H-E染色液(南京建成科技有限公司)。

1.1.3儀器 紫外分析儀(UV-1000，美國(guó)Thermo公司)；多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax i3，美國(guó)Molecular Devices公司)；小動(dòng)物活體成像儀(IVIS Lumina XRMS Series III，美國(guó)Perkin Elmer公司)；小動(dòng)物麻醉機(jī)(XGI-8，美國(guó)Caliper公司)；石蠟切片機(jī)(RM2235，德國(guó)Leica公司)；ECLIPSE 90i正置生物顯微鏡(BX53，日本Olympus公司)；成像分析軟件(Qcapture Pro7.0，美國(guó)Qimaging公司)

1.2方法

1.2.1小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系體外培養(yǎng) 復(fù)蘇液氮保存的MC38細(xì)胞及新構(gòu)建的MC38-luc細(xì)胞株，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1天換液傳代，傳代至3～6次，即可用于轉(zhuǎn)染或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MC38-luc穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MC38細(xì)胞接種于24孔板中，密度為每孔3×105個(gè)，次日細(xì)胞密度達(dá)到90%。按照Lipofectamine 2000的說明書，用50 μL Opti-MEM稀釋1 μL的轉(zhuǎn)染試劑及0.6 μg的pGL4.50質(zhì)粒，室溫靜置5 min后輕輕混勻；混合液室溫放置20 min，加入含0.4 mLOpti-MEM的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染4 h后換成完全培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2中常規(guī)培養(yǎng)。前期用不同濃度梯度的潮霉素(50～500 μg/mL)作用于MC38細(xì)胞，確定MC38細(xì)胞的最佳篩選濃度為150 μg/mL。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10 cm培養(yǎng)皿中，加入潮霉素至終濃度為150 μg/mL，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每1～3 d更換1次含150 μg/mL潮霉素的培養(yǎng)基。篩選2周后，通過胰酶濾紙片克隆消化法挑取克隆，轉(zhuǎn)移至24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行熒光素酶活性的測(cè)定。選取表達(dá)量高的MC38細(xì)胞克隆，通過有限稀釋法篩選穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的亞克隆細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)后行體內(nèi)模型構(gòu)建。

1.2.3單克隆細(xì)胞株的FLuc活性測(cè)定 按照熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明，從每個(gè)待測(cè)定的單克隆細(xì)胞株中取5×105個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌并離心，棄上清，細(xì)胞沉淀各加入100 μL細(xì)胞裂解液(PLB Lysate)，避光裂解20～30 min后，13 000 r/min下離心5 min，收集上清。取10 μL上清液至96孔板中，加入50 μL LARⅡ，避光混勻，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)FLuc活性，判斷陽(yáng)性細(xì)胞克隆及表達(dá)熒光素酶的能力。選取不同克隆的陽(yáng)性細(xì)胞5×105個(gè)進(jìn)行腹腔注射，以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為正常對(duì)照，每組3只小鼠，在接種后每隔4～6 d經(jīng)腹腔注射熒光素酶底物后，通過活體成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞表達(dá)熒光素酶的變化。

1.2.4脾內(nèi)注射途徑構(gòu)建結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC38-luc細(xì)胞，消化后用PBS調(diào)成細(xì)胞密度為1×107mL-1。參照文獻(xiàn)[5]的方法，將C57BL/6小鼠麻醉(腹腔注射5%水合氯醛150 μL)，固定小鼠呈右側(cè)臥位；左側(cè)腋中線與腋后線間，取5 mm切口開腹，用消毒棉簽拉出脾臟至切口外；用4號(hào)針頭吸取細(xì)胞懸液，從脾上極進(jìn)針，保持針頭在脾包膜下平推深度約1.5 cm，邊退邊緩慢注入腫瘤細(xì)胞50 μL(5×105個(gè)細(xì)胞)，可見注射部位的脾臟被膜變白及腫脹；輕輕拔出針頭，用脫脂棉球按壓針眼處，同時(shí)輕輕按揉脾臟至少5 min，促使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入脾靜脈；查看針眼處無(wú)出血，將脾臟放回原位，全層縫合腹壁。術(shù)后繼續(xù)在SPF條件下飼養(yǎng)，次日觀察小鼠狀態(tài)，每隔4～6 d行活體成像檢測(cè)。

1.2.5肝脾組織H-E染色 用含有肝素的0.9% NaCl灌注心臟，待肝組織變?yōu)榘咨?，剪下含腫瘤組織的肝小葉，浸泡于10%甲醛溶液中，固定24 h；常規(guī)脫水，制作石蠟切片。通過H-E染色觀察脾內(nèi)原發(fā)灶及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶腫瘤結(jié)節(jié)的分布情況。

1.2.6小動(dòng)物活體成像檢測(cè) 造模小鼠腹腔注射熒光素酶底物150 mg/kg，5～10 min后再用異氟烷麻醉，麻醉后小鼠置于Lumina Ⅲ操作臺(tái)，固定小鼠呈仰臥位進(jìn)行活體檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株的篩選 抗生素處理2周后，共挑取48個(gè)克隆，第一批測(cè)定了19個(gè)細(xì)胞克隆的熒光素酶活性，結(jié)果如圖1A所示：有14個(gè)克隆存在不同水平熒光素酶表達(dá)，其中13號(hào)克隆的熒光素酶活性最高，為(13 406±734.5)。為了進(jìn)一步確保陽(yáng)性克隆細(xì)胞中熒光素酶呈穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)13號(hào)克隆細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋亞克隆化處理。2塊96孔板中共有36個(gè)克隆生長(zhǎng)，第一批測(cè)定了13個(gè)細(xì)胞克隆的熒光素酶活性，結(jié)果如圖1B所示：s19克隆細(xì)胞熒光素酶表達(dá)水平較低，為(303±19.8)，s14及s27呈較高表達(dá)水平(19 623±1 286，22 733±1 857)，其余克隆呈中等水平表達(dá)。

A：經(jīng)抗生素篩選后的不同細(xì)胞克隆熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果；B：13號(hào)細(xì)胞亞克隆處理后的不同細(xì)胞克隆熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果.圖1 轉(zhuǎn)染pGL4.50質(zhì)粒后MC38細(xì)胞克隆熒光素酶活性的測(cè)定及篩選Fig 1 Luciferase activity detection and positive clones selection of MC38 cell transfected with pGL4.50 plasmid

2.2小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)分析陽(yáng)性克隆細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)增殖能力 選擇較高水平及中等水平表達(dá)熒光素酶的2個(gè)克隆s25及s27分別進(jìn)行腹腔注射，接種后每隔4～6 d用Lumina Ⅲ進(jìn)行小鼠腫瘤熒光素酶活性動(dòng)態(tài)檢測(cè)。由圖2可見：隨著時(shí)間推移，2個(gè)熒光素酶表達(dá)水平不同的MC38-luc細(xì)胞克隆在體內(nèi)成像信號(hào)均不斷提高，提示細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)增殖能力正常。此外，s27克隆的信號(hào)遞增速度較s25更顯著。

A：3組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的成像結(jié)果；B：成像信號(hào).圖2 腹腔接種不同克隆MC38-luc細(xì)胞后熒光素酶活性的測(cè)定Fig 2 Luciferase activity of MC38-luc cell evaluated in mice after intraperitoneal injection of s27 and s25 cell clones

2.3小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移過程 選擇s27細(xì)胞克隆，經(jīng)脾內(nèi)注射途徑構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，結(jié)果顯示：所有造模的小鼠均存活，術(shù)后小鼠活動(dòng)及攝食無(wú)影響，體質(zhì)量無(wú)明顯變化；在建模后第7天，體內(nèi)活體成像檢測(cè)結(jié)果顯示，造模小鼠脾臟接種腫瘤細(xì)胞的部位及肝臟區(qū)域均顯現(xiàn)熒光素酶活性，熒光素主要分布于肝臟的門靜脈區(qū)域；在建模后第14天，脾及肝臟區(qū)域的熒光素酶活性明顯增強(qiáng)，熒光素幾乎分布于整個(gè)肝臟；在建模后第26天，肝臟的熒光素酶活性進(jìn)一步增強(qiáng)并擴(kuò)展到下腹部(圖3)。

2.4結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶及脾原發(fā)灶的大體觀察 分別于脾內(nèi)接種MC38-luc細(xì)胞后的第7，14及26天處死小鼠，大體觀察可見：所有造模小鼠脾內(nèi)可見大小不一的腫瘤結(jié)節(jié)，脾內(nèi)成瘤率為100%，26 d之后，整個(gè)脾臟幾乎布滿腫瘤結(jié)節(jié)，殘存的正常脾組織較少；肝內(nèi)的腫瘤結(jié)節(jié)首先出現(xiàn)在門靜脈區(qū)，肝轉(zhuǎn)移率83.3%(10/12)，26 d之后，不同肝葉均可見大小不一的腫瘤結(jié)節(jié)，肝內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)的大小及存在部位與相應(yīng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)體內(nèi)活體成像技術(shù)測(cè)定的結(jié)果基本一致(圖4)。

2.5結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶及脾原發(fā)灶的H-E染色分析 在建模后第14天取脾內(nèi)及肝內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)行H-E染色，結(jié)果顯示：脾原位腫瘤結(jié)節(jié)生長(zhǎng)迅速，正常的脾組織結(jié)構(gòu)被破壞；肝內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)大小不一的腫瘤轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)，主要圍繞肝血竇分布，其腫瘤細(xì)胞緊密排列，細(xì)胞形態(tài)多樣，核大而深染并可見核分裂(圖5)。

Nor:正常對(duì)照.圖3 熒光素酶活性的活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移過程Fig 3 Luciferase imaging for hepatic metastasis foci of MC38-luc colon cancer

圖4 MC38-luc細(xì)胞造模小鼠肝轉(zhuǎn)移灶及脾組織的大體觀察Fig 4 General observation of liver and spleen tissue from MC38-luc colon cancer hepatic metastases mice

圖5 MC38-luc細(xì)胞造模小鼠脾臟及肝轉(zhuǎn)移灶的H-E染色結(jié)果Fig 5 H-E staining of liver and spleen tissue from MC38-luc colon cancer hepatic metastases mice

3 討 論

長(zhǎng)期以來(lái)，結(jié)直腸癌被認(rèn)為是免疫治療效果欠佳的惡性腫瘤。2015年，Llosa等發(fā)現(xiàn)，基因錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair, MMR)突變導(dǎo)致的微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定型(MSI-H)結(jié)直腸癌癌組織侵襲邊緣有高水平PD-L1表達(dá)及更多CD4+T，CD8+T的浸潤(rùn)[6]。Diaz等也發(fā)現(xiàn)，抗PD-1抗體在MMR突變(dMMR)結(jié)腸癌患者中的客觀反應(yīng)率及疾病控制率均顯著高于MMR正常(pMMR)的患者[7]。文獻(xiàn)報(bào)道，抗PD-1抗體在治療dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中顯示出了令人鼓舞的療效，BRAF基因突變患者的客觀緩解率達(dá)25%，顯著高于常規(guī)化療及靶向治療患者[8]。這些結(jié)果引發(fā)研究者開始關(guān)注免疫治療策略在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌治療中的應(yīng)用。晚期結(jié)直腸癌患者常伴發(fā)肝轉(zhuǎn)移，其機(jī)制復(fù)雜，涉及肝臟特殊的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及肝內(nèi)微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞的相互作用等多種因素[9]。影響結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的最主要因素是缺乏有效的可操作性強(qiáng)的動(dòng)物模型。既往結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型多采用免疫功能缺陷的小鼠進(jìn)行構(gòu)建，僅能用于觀察化療或靶向藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的抑制作用，無(wú)法評(píng)價(jià)免疫治療相關(guān)藥物的療效。由于缺乏免疫功能正常小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，很大程度上限制了結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶免疫微環(huán)境及不同免疫治療方案作用機(jī)制的研究。本研究在免疫功能正常小鼠體內(nèi)初步構(gòu)建了結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。

常用的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株有MC38，MCA18，CT-26及CL25等，其中C57BL/6小鼠遺傳背景的結(jié)腸癌細(xì)胞系有MC38及MCA18及SL4等，BALB/c遺傳背景的結(jié)腸癌細(xì)胞系有CT-26等。其中MC38與CT-26屬于高轉(zhuǎn)移性小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞。前期實(shí)驗(yàn)表明：(1)CT-26細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率極低，而MC38呈現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)染率；(2)抗PD-1對(duì)MC38細(xì)胞小鼠荷瘤模型的治療療效顯著高于CT-26細(xì)胞皮下荷瘤模型(結(jié)果未顯示)。鑒于此，本研究選用MC38小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞，將含有熒光素酶基因的質(zhì)粒(pGL4.50-luc2)轉(zhuǎn)入MC38細(xì)胞系。luc基因表達(dá)產(chǎn)物為FLuc，D-luciferin是熒光素酶的作用底物，通過酶促反應(yīng)產(chǎn)生的熒光具有無(wú)毒、成像時(shí)間短及背景低等優(yōu)點(diǎn)，可作為一種靶細(xì)胞的示蹤劑[10]。Luciferase/luciferin系統(tǒng)是極其敏感的報(bào)告基因方法，通過Xenogen IVIS成像系統(tǒng)可以在活體動(dòng)物體內(nèi)實(shí)時(shí)觀察標(biāo)記細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移情況。小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)通過對(duì)發(fā)光信號(hào)的檢測(cè)而追蹤腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，包括觀察癌細(xì)胞在接種局部的停留、監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移灶最早出現(xiàn)的部位、比較原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞生長(zhǎng)速度等不同情況，從而對(duì)腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制及治療效率的研究提供動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)[11-12]。

本研究通過抗生素篩選并結(jié)合亞克隆方法，獲取穩(wěn)定表達(dá)FLuc基因的MC38細(xì)胞系：先利用潮霉素篩選出高表達(dá)熒光素酶的單克隆細(xì)胞株(13號(hào)陽(yáng)性細(xì)胞株)；再通過亞克隆篩選方法獲得多個(gè)穩(wěn)定表達(dá)FLuc的細(xì)胞克隆。結(jié)果可見，在第一輪抗生素篩選后獲取的13號(hào)細(xì)胞克隆中，并非所有細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因。由于轉(zhuǎn)染后抗生素篩選過程中，質(zhì)粒載體是隨機(jī)整合在細(xì)胞染色體上，有些細(xì)胞雖然整合了外源質(zhì)粒，但整合位置不穩(wěn)定，通過DNA修復(fù)可導(dǎo)致整合的熒光素酶基因失活，但保留抗性基因。該結(jié)果表明，抗生素與亞克隆序貫篩選方案能極大提高篩選陽(yáng)性克隆的概率，且確保篩選所得的陽(yáng)性克隆穩(wěn)定表達(dá)外源導(dǎo)入的目的基因。本研究最后選取中等及高水平表達(dá)的2個(gè)亞克隆細(xì)胞株s25號(hào)及s27進(jìn)行腹腔注射荷瘤。小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)顯示，在體內(nèi)生長(zhǎng)增殖能力正常且s27克隆的熒光信號(hào)遞增速度較s25更顯著。因此，選擇s27細(xì)胞克隆用于構(gòu)建結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型。

目前，在免疫功能正常小鼠體內(nèi)構(gòu)建結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型常用的方法有脾內(nèi)注射法、門靜脈注射法、肝內(nèi)直接注射法、腸黏膜下原位注射法及盲腸原位造疝法等[13-16]。本研究采用脾內(nèi)注射法構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，造模后小鼠存活率達(dá)100%，肝轉(zhuǎn)移率達(dá)83.3%。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，注射腫瘤細(xì)胞時(shí)，保持針頭在脾包膜下并適當(dāng)按揉可有效提高肝轉(zhuǎn)移率。小動(dòng)物活體成像可在建模后7 d左右測(cè)到肝轉(zhuǎn)移灶的熒光信號(hào)，在建模后14 d肝臟轉(zhuǎn)移灶熒光素明顯增強(qiáng)?；铙w成像熒光信號(hào)的出現(xiàn)和遞增與肉眼下觀察到腫瘤進(jìn)展過程基本同步。H-E染色確證肝轉(zhuǎn)移灶為多發(fā)結(jié)節(jié)且圍繞肝血竇分布。由此可見，脾包膜下接種MC38-luc細(xì)胞是一種簡(jiǎn)單、有效、重復(fù)性好的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法。

本研究篩選了穩(wěn)定高表達(dá)熒光素酶基因的MC38-luc小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株，通過脾內(nèi)注射途徑在免疫功能正常小鼠體內(nèi)構(gòu)建了結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，通過活體成像技術(shù)觀察到熒光素酶在小鼠肝內(nèi)的遞增過程。這些研究結(jié)果為后續(xù)深入研究小鼠結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的免疫學(xué)機(jī)制及免疫治療策略奠定了重要的細(xì)胞及動(dòng)物模型基礎(chǔ)。