內(nèi)皮抑素30肽對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性和黏附能力的影響

于佳琪 趙航 楊揚(yáng) 魏欣鵬 牛淑冬 李淑艷

[摘要]目的 探討內(nèi)皮抑素30肽對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性和黏附能力的影響。方法 將內(nèi)皮抑素氨基端的1～31位氨基酸（將25～31位序列由RGIRGAD改為RGDRGD）對(duì)應(yīng)的核苷酸序列連接到質(zhì)粒pTYB2中，再轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21（DE3）中表達(dá)，合成由30個(gè)氨基酸構(gòu)成的30肽。結(jié)果 HepG2細(xì)胞經(jīng)0、20、40、60、80、100 μg/ml的30肽分別處理24、48 h后，細(xì)胞的增殖活性和黏附能力均被抑制，呈時(shí)間劑量依賴(lài)性，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 內(nèi)皮抑素30肽能有效抑制HepG2細(xì)胞的增殖和黏附，在臨床上有望成為肝癌的輔助治療手段之一。

[關(guān)鍵詞]內(nèi)皮抑素；增殖；黏附；肝癌

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）9（c）-0008-04

The influence of Endostatin 30 peptide on proliferative activity and adhesion ability of HepG2 cell

YU Jia-qi1 ZHAO Hang1 YANG Yang1 WEI Xing-peng1 NIU Shu-dong2 LI Shu-yan3▲

1. Qiqihar Medical School， Heilongjiang Province， Qiqihar 161006， China； 2. Department of Physiology， Qiqihar Medical School， Heilongjiang Province， Qiqihar 161006， China； 3. Department of Biochemistry， Qiqihar Medical School， Heilongjiang Province， Qiqihar 161006， China

[Abstract] Objective To investigate the influence of Endostatin 30 peptide on proliferative activity and adhesion ability of HepG2 cell for liver cancer. Methods The nucleotide sequences corresponding to amino-terminal 1-31 amino acids of endostatin （change the 25-31 bit sequence from RGIRGAD to RGDRGD） were linked to plasmid pTYB2， then converted to the expression of Escherichia coli BL21 （DE3） and synthesize 30 peptides composed of 30 amino acids. Results After HepG2 cells were treated by 30 peptide of 0， 20， 40， 60， 80， 100 μg/ml for 24， 48 h， the proliferative activity and adhesion of cells were inhibited in time and dose dependent， and compared with the control group， there was a significant difference （P<0.05）. Conclusion Endostatin 30 peptide can effectively inhibit the proliferation and adhesion of HepG2 cell， which is expected to become one of the adjuvant therapies for liver cancer.

[Key words] Endostatin； Proliferation； Adhesion； Liver cancer

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率位居第二，其特點(diǎn)是惡性程度高，病情進(jìn)展快，術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療等的治療效果均不理想，因此，探索高效低毒的抗腫瘤新藥是醫(yī)藥衛(wèi)生工作者的首要任務(wù)。2005年，Robert等將內(nèi)皮抑素分為8個(gè)肽段（hP1～hP8），分別研究其抗腫瘤活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，內(nèi)皮抑素的hP1肽段（即內(nèi)皮抑素的1～27位氨基酸構(gòu)成的肽段）抗腫瘤活性接近于內(nèi)皮抑素，其他肽段無(wú)活性[1]。2007年黑龍江省生物醫(yī)藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉興漢教授利用定點(diǎn)誘變技術(shù)對(duì)內(nèi)皮抑素氨基端的1～31位氨基酸對(duì)應(yīng)的核苷酸序列進(jìn)行改造，并將25～31位氨基酸序列由RGIRGAD改為RGDRGD，合成了由30個(gè)氨基酸構(gòu)成的30肽[2]（簡(jiǎn)稱(chēng)30肽）。改造后的30肽包含兩個(gè)RGD序列，易與腫瘤細(xì)胞膜上的整合素結(jié)合，進(jìn)而增強(qiáng)30肽的抗腫瘤活性。本研究選擇人肝癌細(xì)胞HepG2為研究對(duì)象，探討內(nèi)皮抑素30肽對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性和黏附能力的影響，為肝癌的生物治療提供試驗(yàn)依據(jù)和臨床應(yīng)用的可能性。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

酵母提取物、胰蛋白胨、IPTG、EDTA、葡聚糖凝膠G15、Matrigel（E1270）（Sigma公司）；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青）；胰酶（Invitrogen公司）；WST-1試劑盒（Roche公司）；幾丁質(zhì)層析樹(shù)脂（NEB公司）；人肝癌細(xì)胞株HepG2（本室保存）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 30肽的表達(dá)及純化 參考Wang等[3]的純化方法，從構(gòu)建的pTYB2-T30基因工程表達(dá)菌中提取30肽，經(jīng)幾丁質(zhì)親和層析純化后，通過(guò)Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定其純度。

1.2.2 30肽對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的抑制實(shí)驗(yàn) 常規(guī)方法培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞后，在96孔板中接種相同數(shù)量的HepG2細(xì)胞（每板留1個(gè)孔用作空白對(duì)照孔）。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，向各孔中分別加入30肽（濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/ml，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔），37℃孵箱中分別處理24、48 h，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，每孔加入100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基和10 μl WST-1，37℃孵育1 h。選擇450 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，630 nm為參考波長(zhǎng)，用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定各孔吸光度值。

1.2.3 30肽對(duì)HepG2細(xì)胞異型黏附能力的影響 本實(shí)驗(yàn)將Matrigel鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后加入不同濃度30肽處理的HepG2細(xì)胞，MTT法檢測(cè)30肽對(duì)HepG2細(xì)胞細(xì)胞異型黏附能力的影響。

實(shí)驗(yàn)參考Wickstrom等[4-5]的方法。設(shè)立對(duì)照組和30肽組。在96孔培養(yǎng)板每孔中分別鋪上2 μg Matrigel 4℃過(guò)夜，加入2%BSA 20 μl/孔，置于22℃ 1 h，PBS沖洗。HepG2細(xì)胞用0、20、40、60、80、100 μg/ml的30肽分別預(yù)孵育24、48 h，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，100 μl/孔加入細(xì)胞懸液，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育90 min。用PBS沖洗掉未黏附的細(xì)胞，加入MTT 20 μl /孔，孵育4 h后棄去MTT，加入100 μl/孔DMSO。用酶標(biāo)儀在570 nm測(cè)定吸光度值，計(jì)算各組的相對(duì)黏附率，每組設(shè)3個(gè)平行對(duì)照，重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用方差分析，采用線(xiàn)性回歸分析計(jì)算30肽的半數(shù)抑制濃度（IC50），以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 30肽的表達(dá)及純化

重組的內(nèi)皮抑素30肽經(jīng)幾丁質(zhì)層析樹(shù)脂親和層析后，葡聚糖凝膠G15去除DTT干擾，分別取5、2 μg進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE小肽電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1，在分子量3 kDa左右出現(xiàn)特異條帶。

2.2 30肽對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的抑制作用

在96孔板中接種相同數(shù)量的HepG2細(xì)胞，向各孔中分別加入濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/ml的30肽，37℃孵箱中分別處理24、48 h后，HepG2細(xì)胞的增殖活性均被抑制，呈時(shí)間劑量依賴(lài)性。應(yīng)用線(xiàn)性回歸分析計(jì)算30肽的IC50為49.7 μg/ ml（圖2）。

2.3 30肽對(duì)HepG2細(xì)胞黏附能力的抑制作用

在HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的30肽（0、20、40、60、80、100 μg/ml），培養(yǎng)24 、48 h，顯示30肽能顯著抑制HepG2細(xì)胞對(duì)基質(zhì)膠Matrigel的黏附（P<0.05），呈時(shí)間劑量依賴(lài)性（圖3）。

3討論

腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移離不開(kāi)新生血管的形成，內(nèi)皮抑素位于膠原蛋白ⅩⅧ C末端的第一非膠原結(jié)構(gòu)區(qū)域[6-7]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、改善肺纖維化的作用，且與其他多種疾病相關(guān)[8-10]。因此，內(nèi)皮抑素日益得到研究者的關(guān)注和重視。

內(nèi)皮抑素通過(guò)抑制腫瘤組織新生血管的生成，斷絕腫瘤細(xì)胞的血液供應(yīng)，使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，間接地抑制腫瘤的生長(zhǎng)，已作為一種抗腫瘤藥物用于臨床。但在臨床治療中，內(nèi)皮抑素存在單獨(dú)注射所需劑量大，內(nèi)皮抑素蛋白不穩(wěn)定，停藥后易復(fù)發(fā)等不足，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造以減少其毒副作用是臨床應(yīng)用的發(fā)展趨勢(shì)。人工構(gòu)建的30肽不僅包括內(nèi)皮抑素的1～27位氨基酸活性區(qū)，還含有2個(gè)重復(fù)的由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成的RGD序列[11-12]。RGD序列主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白中，通過(guò)與多種整合素特異性結(jié)合[13-14]，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)生物材料的黏附，抑制腫瘤血管生成，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移及凋亡等多種活動(dòng)[15-16]。本研究采用WST-1試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)活性，實(shí)驗(yàn)中選擇了人肝癌HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，在96孔板中接種相同數(shù)量的HepG2細(xì)胞，向各孔中分別加入濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/ml的30肽，37℃ 5%CO2孵箱中分別處理24、48 h后，HepG2細(xì)胞的增殖均被抑制，呈時(shí)間劑量依賴(lài)性。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)連續(xù)、漸進(jìn)的多因素、多步驟的動(dòng)態(tài)過(guò)程，涉及原發(fā)腫瘤細(xì)胞的生存發(fā)展，腫瘤細(xì)胞增殖能力和生存能力的增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞黏附性的改變，腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)并隨著血液循環(huán)轉(zhuǎn)移等過(guò)程[17-18]。腫瘤細(xì)胞的黏附性改變?cè)谀[瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中極為重要。細(xì)胞黏附可分為細(xì)胞與細(xì)胞間黏附及細(xì)胞與ECM黏附。細(xì)胞與細(xì)胞間黏附異常時(shí)，腫瘤細(xì)胞易從原發(fā)灶脫落并黏附到ECM和基底膜，這是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程的第一步[19]。ECM的主要成分是纖維粘連蛋白（FN）、層粘連蛋白（LN）和Ⅳ型膠原蛋白，本研究在體外黏附實(shí)驗(yàn)中采用Matrigel（主要成分是FN、LN和Ⅳ型膠原蛋白）作為黏附基質(zhì)，模擬體內(nèi)黏附過(guò)程。實(shí)驗(yàn)顯示，HepG2細(xì)胞對(duì)人工基底膜膠Matrigel具有較強(qiáng)的黏附能力，加入30肽后，從40 μg/ml開(kāi)始，腫瘤細(xì)胞對(duì)Matrigel的黏附能力明顯降低，并呈時(shí)間劑量依賴(lài)性，提示30肽可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)基質(zhì)成分的黏附作用來(lái)降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，為臨床上生物活性肽用于腫瘤治療提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)[20-22]。

終上所述，內(nèi)皮抑素30肽能有效抑制HepG2細(xì)胞的增殖和黏附，在臨床上有望成為肝癌的輔助治療手段之一，30肽對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制是今后本課題的主要研究目標(biāo)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Tjin Tham Sjin RM，Satchi-Fainaro R，Birsner AE，et al.A 27-amino-acid synthetic peptide corresponding to the NH2 terminal zinc-binding domain of endostatin is responsible for its antitumor activity[J].Cancer Res，2005，65（9）：3656-3663.

[2]Li D，Liu X，Zhao W，et al.Gene cloning，expression and activity of anti -tumor peptide of human endostatin[J].J Med Mol Biol，2007，4（6）：475-479.

[3]Wang SJ，Liu XH，Ji YB，et al.Study on biological activity of two modified anti-tumor peptide of tumstatin[J].Prog Biochem Biophys，2007，34（11）：1152-1161.

[4]Wickstrom SA，Alitalo K，Keski-Oja J.An endostatin-derived peptide interacts with integrins and regulates actin cytoskeleton and migration of endothelial Cells[J].J Biol Chem，2004， 279（9）：20 178-20 185.

[5]Chen BQ，Yang YM，Gao YH，et al.Inhibitory effects of c9，t11-conjugated linoleic acid on invasion of human gastric carcinoma cell line SGC-7901[J].World J Gastroenterol，2003， 9（9）：1909-1914.

[6]Poluzzi C，Iozzo RV，Schaefer L.Endostatin and endorepellin：A common route of action for similar angiostatic cancer avengers[J].Adv Drug Deliv Rev，2016，97：156-173.

[7]O′Reilly MS，Boehm T，Shing Y，et al.Endostatin：An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth [J].Cell，1997， 88（2）：277-285.

[8]曲波，秦曉風(fēng).重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合卡培他濱及奧沙利鉑治療胃腸癌合并惡性腹腔積液的療效[J].中國(guó)腫瘤臨床與康復(fù)，2018，25（4）：443-445.

[9]Wan YY，Tian GY，Guo HS，et al.Endostatin，an angiogenesis inhibitor，ameliorates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J].Respir Res，2013，14（1）：56-68.

[10]韓敏，王堅(jiān)，王久勝.重組人內(nèi)皮抑素結(jié)合化療對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌患者血清LMTK-3和IGFBP-7的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2018，28（9）：55-59.

[11]Thysiadis S，Katsamakas S，Dalezis P，et al.Novel c（RGDyK）-based conjugates of POPAM and 5-fluorouracil for integrin-targeted cancer therapy[J].Future Med Chem，2017，9（18）：2181-2196.

[12]Bartolomé RA，Peláez-García A，Gomez I，et al.An RGD motif present in cadherin 17 induces integrin activation and tumor growth[J].J Biol Chem，2014，289（50）：34 801-34 814.

[13]Boudjadi S，Carrier JC，Groulx JF，et al.Integrin α1β1 expression is controlled by c-MYC in colorectal cancer cells[J].Oncogene，2016，35（13）：1671-1678.

[14]Nieberler M，Reuning U，Reichart F，et al.Exploring the role of RGD-recognizing integrins in cancer[J].Cancers，2017，9（9）：116-149.

[15]Xie F，Ding RL，He WF，et al.In vivo antitumor effect ofendostatin-loaded chitosan nanoparticles combined with paclitaxel on Lewis lung carcinoma[J].Drug Deliv，2017，24（1）：1410-1418.

[16]Wang X，Zhan RY，Wang YY，et al.Endostatin improves cancer-associated systemic syndrome in a lung cancer model[J].Oncol Lett，2015，9（5）：2023-2030.

[17]王崢嶸，龐靜歡，周艷，等.FXR mRNA表達(dá)量與肝惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移關(guān)系探討[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2017，55（7）：1-4.

[18]李永慶，尚培中，柳勇，等.VEGF和SLeX表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2016，13（21）：5-8.

[19]Erreni M，Siddiqui I，Marelli G，et al.The Fractalkine-receptor axis improves human colorectal cancer prognosis by limiting tumor metastatic dissemination[J].J Immunol，2016， 196（2）：902-914.

[20]吳迅.重組人血管內(nèi)皮抑素時(shí)間窗研究進(jìn)展[J].西部醫(yī)學(xué)，2017，29（12）：1777-1780.

[21]Rosca EV，Koskimaki JE，Rivera CG，et al.Anti-angiogenic peptides for cancer therapeutics[J].Curr Pharm Biotechnol，2011，12（8）：1101-1116.

[22]Hamley IW.Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics[J].Chem Rev，2017，117（24）：14 015-14 041.

（收稿日期：2017-12-14 本文編輯：許俊琴）