云南地區(qū)漢族脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型SCA3/MJD患者的臨床特點(diǎn)及遺傳學(xué)研究

張林明 李陶樂 段尉梅 張玉林 陳玲 戴淑娟 艾青龍 徐忠

[摘要] 目的 通過對(duì)云南地區(qū)臨床診斷為脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)的家系進(jìn)行SCA3基因檢測(cè)，探討漢族人群遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型（spinocerebellar ataxia type 3，SCA3）患者臨床特點(diǎn)與遺傳學(xué)特征。 方法 對(duì)4個(gè)家系26例脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)患者進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)檢查和家系譜調(diào)查，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、瓊脂糖凝膠電泳和基因測(cè)序等技術(shù)進(jìn)行 SCA3 基因內(nèi)CAG三核苷酸重復(fù)序列，并對(duì)異常等位基因片段進(jìn)行DNA測(cè)序。 結(jié)果 臨床表現(xiàn)以共濟(jì)失調(diào)和構(gòu)音障礙為主，其次表現(xiàn)為錐體束征、眼部癥狀等，認(rèn)知功能障礙較少見。檢出4個(gè)家系（26例患者）為SCA3，符合常染色體顯性遺傳特點(diǎn)，測(cè)序證實(shí)其異常等位基因CAG重復(fù)數(shù)目在67～82次之間。 結(jié)論 云南地區(qū)漢族的SCAs患者以SCA3型為主，主要表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)和構(gòu)音障礙，基因檢測(cè)仍是其診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。

[關(guān)鍵詞] 漢族；脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型；體征和癥狀；基因型；三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增

[中圖分類號(hào)] R744.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）27-0004-03

[Abstract] Objective To investigate the clinical characteristics and genetic characteristics of patients with hereditary spinocerebellar ataxia type 3（SCA3） in Han population by SCA3 gene detection in the family of clinical diagnosis of spinal cord cerebellar ataxia in Yunnan. Methods Neurological examination and family pedigree survey were performed on 26 patients with spinal cord cerebellar syndrome in 4 families. Polymerase chain reaction（PCR）， agarose gel electrophoresis and gene sequencing were used to carry out CAG trinucleotide repeats in SCA3 gene. And DNA sequencing of abnormal allelic fragments was performed. Results The clinical manifestations were mainly ataxia and dysarthria， followed by pyramidal tract signs and eye symptoms. Cognitive dysfunction was less common. 4 families（26 patients） were detected as SCA3， consistent with autosomal dominant inheritance. Sequencing confirmed that the number of abnormal allele CAG repeats was between 67 and 82 times. Conclusion SCA3 type is the main type of SCAs in Han nationality in Yunnan， mainly characterized by ataxia and dysarthria. Genetic testing is still the gold standard for diagnosis.

[Key words] Han nationality； Spinal cerebellar ataxia type 3； Signs and symptoms； Genotype； Trinucleotide repeat amplification

脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)（spinocerebellar ataxia，SCA）是一組以共濟(jì)失調(diào)為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，伴隨有眼球活動(dòng)障礙、錐體束受損、周圍神經(jīng)病及認(rèn)知功能障礙等癥狀[1]，以常染色體顯性遺傳為主，該類疾病各亞型臨床表現(xiàn)復(fù)雜，癥狀間存在交叉，因此臨床分型及鑒別診斷十分困難。1992年Volz首次報(bào)道了脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)1型（SCA-1）的基因位點(diǎn)，從此開啟了對(duì)SCAs的基因診斷和發(fā)病機(jī)制的研究，目前為止發(fā)現(xiàn)約40余種亞型[2]，SCA3/MJD（又稱馬查多-約瑟夫病，Machado-Joseph disease，MJD）是最常見的亞型[3]。1994年Kawaguchi發(fā)現(xiàn)該基因定位于常染色體14q32.1，該基因10號(hào)外顯子區(qū)的（CAG）n異常重復(fù)擴(kuò)增是該病的遺傳學(xué)病因[4]。為了解云南地區(qū)SCA3/MJD患者是否具有獨(dú)特的臨床特點(diǎn)與遺傳學(xué)特征，我們對(duì)4個(gè)云南地區(qū)漢族SCA家系進(jìn)行檢測(cè)和分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和云南省第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收集的共4個(gè)家系26例患者（男14例，女12例，平均年齡39.2±4.2歲）和7例“健康”家系成員（即無(wú)臨床癥狀的家系成員，男4例，女3例，平均年齡33.0±5.7歲），均為漢族，所有家系均來(lái)自云南各地州。臨床診斷依據(jù)Harding標(biāo)準(zhǔn)[5]。另選擇同期在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和云南省第三人民醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的30例正常人（男15例，女15例，平均年齡38.2±5.1歲，漢族，無(wú)家族遺傳病史，與上述家系均無(wú)血緣關(guān)系，神經(jīng)系統(tǒng)查體無(wú)陽(yáng)性體征）作為對(duì)照組。

1.2研究方法

1.2.1 外周血DNA提取 抽取SCAs患者、“健康”家系成員和正常對(duì)照組外周血4 mL，采取標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿抽提法提取DNA作為PCR模板。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)[6]合成引物：SCA3-F：5-CCAGTGACTACTTTGATT CG-3；SCA3-R：5-TGGCCTT TCACATGG ATGTGA A-3。25 μL反應(yīng)體系：10×PCR Burffer 2.5 μL，20 mmol/L mg2+1.875 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，Taq酶（5U/μL）0.2 μL，Primers（0.1 μg/μL）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR 擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s；不同退火溫度55℃退火40 s；72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min；4℃保存；共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物檢測(cè)：使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后在自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.2.3毛細(xì)管電泳片段分析 使用Genescan軟件分析結(jié)果，CAG重復(fù)拷貝數(shù)=[DNA片段長(zhǎng)度（bp）-側(cè)翼區(qū)長(zhǎng)度（bp）]/3。

1.2.4 DNA 將純化后的PCR產(chǎn)物與PMD-19T載體16℃，60min連接反應(yīng)；取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克?。蝗￡?yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，提取質(zhì)粒后利用AB1377測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序結(jié)果序列對(duì)比使用NCBIBlast完成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，在相關(guān)性分析中，資料符合正態(tài)分布，采用Pearson相關(guān)分析，否則采用 Spearman 相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 SCA3/MJD患者的臨床特點(diǎn)

4個(gè)家系的26例患者，男14例，女12例，發(fā)病年齡20～53（39.5±5.3）歲，病程2～19年，符合常染色體顯性遺傳特征。所有患者均有程度不等的共濟(jì)失調(diào)和構(gòu)音障礙，其次表現(xiàn)為錐體束征17例（65%），眼外肌麻痹13例（50%），感覺障礙12例（46%），眼球震顫9例（34%），認(rèn)知功能障礙較少見有4例（15%）。

2.2 SCA3/MJD的基因診斷

SCA3/MJD基因診斷標(biāo)準(zhǔn)為CAG重復(fù)次數(shù)≥62次，檢測(cè)結(jié)果顯示，4個(gè)家系中有26例患者達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)，可以診斷為SCA3/MJD患者，CAG重復(fù)次數(shù)為67～82（74.1±5.8）次；癥狀前患者7例（男4例，女3例）突變等位基因CAG重復(fù)次數(shù)為62～80（67.2±6.8），正常對(duì)照組CAG重復(fù)次數(shù)為14～46（38.4±2.1）（圖1）。

2.3 SCA3/MJD臨床癥狀與CAG重復(fù)次數(shù)的關(guān)系研究

2.3.1 發(fā)病年齡與CAG重復(fù)次數(shù)的相關(guān)性 26例SCA3/MJD患者的發(fā)病年齡與CAG重復(fù)次數(shù)有顯著的負(fù)相關(guān)性，Pearson相關(guān)系數(shù)r=1.241，P<0.01，CAG重復(fù)次數(shù)越多，發(fā)病年齡越早。

2.3.2 SARA評(píng)分與CAG重復(fù)次數(shù)的相關(guān)性 26例SCA3/MJD患者的SARA評(píng)分與CAG重復(fù)次數(shù)無(wú)相關(guān)性，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.248，P>0.05。

3討論

脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)各亞型臨床表現(xiàn)復(fù)雜，具有高度的臨床變異性和遺傳異質(zhì)性。Tang B等[7]研究表明，SCA3/MJD是中國(guó)最普遍的類型，我們研究的4個(gè)家系均為SCA3，進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)論。

SCA3/MJD臨床表現(xiàn)復(fù)雜，分為4種亞型[8]：1型小腦癥狀不明顯或較輕，可有面、舌部肌束震顫和突眼，多于45歲左右死亡；2型20～45歲發(fā)病，有明顯的小腦及錐體系或椎體外系癥狀，病情較輕，死亡年齡約60歲；3型40～60歲發(fā)病，表現(xiàn)為小腦癥狀及遠(yuǎn)端肌肉無(wú)力，感覺減退，深反射低下或消失，病情進(jìn)展較慢；4型以帕金森癥狀為特點(diǎn)。本研究中報(bào)道的病例發(fā)病年齡20～53歲，所有患者均有共濟(jì)失調(diào)和構(gòu)音障礙，以2、3型為主，但病例數(shù)較少，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以便發(fā)現(xiàn)SCA3/MJD的其他亞型。

目前報(bào)道的SCA3/MJD患者CAG重復(fù)次數(shù)存在一定差異：國(guó)外的報(bào)道次數(shù)61～89次不等，其中最低為45次[9]；國(guó)內(nèi)不同地區(qū)存在差異：寧夏地區(qū)為66～81次[10]，廣西地區(qū)為68～78次[11]，重慶地區(qū)為58～71次[9]，河南地區(qū)為70～79次[12]，國(guó)內(nèi)最低為43次。本研究中云南地區(qū)漢族SCA3/MJD患者CAG的重復(fù)次數(shù)67～82次，癥狀前患者為62～80次，與國(guó)內(nèi)研究基本一致。

SCA3/MJD具有遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象，其基礎(chǔ)是CAG重復(fù)次數(shù)在代間的不穩(wěn)定擴(kuò)增的結(jié)果，下一代CAG的重復(fù)次數(shù)較上一代增多，本研究中發(fā)現(xiàn)云南地區(qū)漢族SCA3/MJD患者的發(fā)病年齡與CAG重復(fù)次數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，CAG重復(fù)次數(shù)越多，發(fā)病年齡越早，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致[11，13]。本研究中發(fā)現(xiàn)4個(gè)家系中均存在下一代較上一代發(fā)病年齡提前、病情嚴(yán)重的情況。

Shang-Ran Huang[14]在研究中發(fā)現(xiàn)CAG重復(fù)次數(shù)與患者SARA評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與本文研究一致；在研究脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)方面，國(guó)際協(xié)作共濟(jì)失調(diào)評(píng)估量表（ICARS）與SARA評(píng)分都用來(lái)評(píng)估患者共濟(jì)失調(diào)的嚴(yán)重程度，顧衛(wèi)紅等[15]在其類似研究中發(fā)現(xiàn)，ICARS評(píng)分與CAG重復(fù)次數(shù)無(wú)關(guān)，但與患者的病程顯著相關(guān)；Carlos等[16]研究發(fā)現(xiàn)SARA評(píng)分與灰質(zhì)體積呈負(fù)相關(guān)，這些前期的研究成果提供更廣泛的思路，我們將進(jìn)一步收集病例，研究病程、灰質(zhì)體積、SARA評(píng)分間相互關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)亞型眾多，臨床表型復(fù)雜，通過基因檢測(cè)可以做出準(zhǔn)確的診斷，云南地區(qū)脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)以SCA3/MJD為主，這為我們進(jìn)一步研究該類型疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-09-28）