外泌體源性oar-miR-10b在綿羊痘病毒感染綿羊睪丸細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及靶基因的鑒定

孔賀磊，吳金恩，鄭亞東，何貴天，李雅婷，丁軍濤*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046)

MicroRNA(miRNA)是一類長度為19個(gè)～23個(gè)核苷酸、參與調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子[1]，廣泛存在于各種動(dòng)物、植物和病毒中。miRNA能通過與mRNA 3′UTR以完全或不完全配對的方式降解或抑制靶基因的表達(dá)，具有調(diào)控生物體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤形成及病毒感染等多種生物學(xué)功能[2]。已有研究報(bào)道，哺乳動(dòng)物有50%以上的蛋白表達(dá)基因受miRNA調(diào)控[3]。病毒作為一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生病原體，它的感染會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)RNA的動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生改變，特別是細(xì)胞內(nèi)miRNA。目前已有研究證實(shí)，哺乳動(dòng)物痘病毒和痘苗病毒能通過自身編碼的Poly A聚合酶VP55降解宿主細(xì)胞中的miRNA[4]，從而為痘病毒的感染創(chuàng)造條件。由此可見，痘病毒的感染過程與miRNA之間存在一定的相應(yīng)關(guān)系。

作為miRNA的一員，miR-10b不僅在哺乳動(dòng)物中廣泛分布，而且具有高度保守性，這暗示著miR-10b在生物體中可能扮演著重要角色。已有大量研究表明，miR-10b在腫瘤細(xì)胞中普遍高表達(dá)，如在肝癌[5]、食管癌[6]、胰腺癌[7]和鼻咽癌[8]等腫瘤組織中都有異常表達(dá)，這種異常與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]，且不影響細(xì)胞的活力和增殖能力。但是有關(guān)miR-10b在病毒感染方面的研究報(bào)道很少。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過Cytoscape生物信息軟件中的bioNGO插件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)oar-miR-10b分別與PAPOLA、HOXA1、INHBB、GATAD2A及BCL2L2等基因相互作用。已有研究證實(shí)[10-11]，PAPOLA、HOXA1、INHBB、GATAD2A等基因主要參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，而BCL2L2基因參與細(xì)胞凋亡過程。當(dāng)BCL2L2的表達(dá)量升高時(shí)，細(xì)胞的凋亡就會(huì)受到抑制，這可能進(jìn)而為病毒的存活、繁殖和潛伏感染提供條件。

本研究以綿羊痘病毒(Sheop poxvirus,SPPV)感染綿羊睪丸細(xì)胞4 h后外泌體中miRNA的高通量測序結(jié)果為基礎(chǔ)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測綿羊痘病毒感染綿羊睪丸細(xì)胞0、4、24、48、72 h外泌體中oar-miR-10b的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化情況，驗(yàn)證基因BCL2L2與oar-miR-10b的相互作用關(guān)系，為進(jìn)一步研究oar-miR-10b在綿羊痘病毒感染過程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

綿羊睪丸細(xì)胞、293FT細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自北京全式金生物有限公司；限制性內(nèi)切酶SacⅠ、XhoⅠ、DNA Marker、T4 DNA連接酶、克隆載體pMD18-T、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司；cel-miR-39、引物、BCL2L2-MUT和oar-miR-10b的合成及測序均由上海生物科技有限公司完成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑購自上海生工生物工程有限公司；Trizol LS 試劑及脂質(zhì)體 R2000 Reagent購自Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告載體PmirGLO、DualGGlo RLuciferase Assay System檢測試劑盒購自Promega公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均購于天根科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 從miRBase數(shù)據(jù)庫中查取miR-10b序列，并選取Cel-miR-39作為外參基因，用DNAMAN和Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成(表1)。

表1 oar-mir-10b和Cel-miR-39基因擴(kuò)增引物

1.2.2 Oar-miR-10b和Cel-miR-39的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)液總外泌體提取試劑(invitrogen)分別分離感染綿羊痘病毒0 h、4 h、24 h、48 h和72 h后的綿羊睪丸細(xì)胞的外泌體，同時(shí)，不同時(shí)期的外泌體中分別加入人工合成的Cel-miR-39基因作為外參基因。應(yīng)用Trizol LS分別提取5個(gè)不同時(shí)期外泌體中的總RNA，并以其為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條鏈(圖1)，將合成的cDNA按照10倍梯度稀釋后，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作，將反應(yīng)溶液充分混勻后，按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

圖1 miRNA檢測原理

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建 轉(zhuǎn)化、提取PmirGLO空載體并進(jìn)行雙酶切，將雙酶切的目的片段BCL2L2和PmirGLO 16℃過夜連接，將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)18 h后提取重組質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測 取生長狀態(tài)良好的293FT細(xì)胞，以5×104CPU接種于96孔板，過夜培養(yǎng)后，棄掉培養(yǎng)液后每孔加入100 μL的DMEM無血清培養(yǎng)基，置于室溫平衡15 min以上。每孔加入100 μL的Dual-Glo?Luciferase Reagent，室溫下避光放置15 min以上，用GloMax96熒光檢測儀檢測螢火蟲熒光素酶活性并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。加入100 μL的Dual-Glo?Stop&Glo?Reagent后至少等待15 min后再檢測海腎熒光素酶活性。海腎熒光素酶活性檢測方法同螢火蟲熒光素酶活性檢測方法相同，加入100 μL的Dual-Glo?Luciferase Reagent，室溫避光放置15 min后，用GloMax96熒光檢測儀檢測海腎熒光素酶活性并記錄數(shù)值。

分組如下。A組：PmirGLO空載體+Oar-mir-10b類似物；B組：PmirGLO空載體+陰性對照(NC)；C組：PmirGLO BCL2L2-WT+Oar-mir-10b類似物；D組：PmirGLO BCL2L2-WT+陰性對照(NC)；E組：PmirGLO BCL2L2-MUT+Oar-mir-10b類似物；F組：PmirGLO BCL2L2-MUT+陰性對照(NC)。

轉(zhuǎn)染體系的配制：以A組為例，取無RNA酶1.5 mL EP管3個(gè)，分別標(biāo)記為A1、A2和A3，在A1管中加入98 μL DMEM無血清培養(yǎng)基和1 μL PmirGLO空載體(0.45 μg/mL)，A2中加入98.2 μL DMEM無血清培養(yǎng)基1.8 μL脂質(zhì)體2000，A3中加入95 μL無血清培養(yǎng)基10 μL Oar-mir-10b類似物，各管混勻后冰上靜置5 min。分別在A2管中取50 μL混合液加入A1和A3，混勻后室溫靜置5 min。將A1和A3混勻，室溫靜置10 min。同理配制其他組溶液。在無菌條件下，將各組混合液吸取100 μL分別加入96孔板對應(yīng)組內(nèi)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進(jìn)行熒光檢測。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Prism 5對各組的雙熒光素酶活性比值進(jìn)行分析，并用One-way ANOVA進(jìn)行組內(nèi)的差異性分析，而組間則用Student′s t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。*代表P<0.05，**代表P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 外參cel-miR-39基因檢測及oar-miR-10b在病毒感染不同時(shí)段的動(dòng)態(tài)表達(dá)分析

從cel-miR-39的溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線以及miR-10b的溶解曲線可知，兩種引物都具有較高的特異性。分別在綿羊痘病毒感染綿羊睪丸細(xì)胞后0 h、4 h、24 h、48 h和72h對外泌體中的oar-miR-10b進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明，在綿羊痘病毒感染的不同時(shí)期，外泌體中的oar-miR-10b呈現(xiàn)不同的差異表達(dá)，主要為先增加后減少的趨勢，在感染后24 h的差異表達(dá)量最大，達(dá)到2.15倍(圖2)，隨后逐步降低。感染4 h后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與高通量測序結(jié)果分析表明，miR-10b的變化情況基本一致。

2.2 BCL2L2 RT-PCR擴(kuò)增

對提取的細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后，將所得產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示目的條帶大小在220 bp左右，與預(yù)期目的條帶大小一致(圖3)。

2.3 pMD-18-T-BCL2L2-WT、PmirGLO-BCL2L2-WT、PmirGLO-BCL2L2-MUT重組質(zhì)粒的鑒定

根據(jù)DNA純化試劑盒說明書將目的片段回收純化后，與pMD-18-T載體進(jìn)行過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中并挑取單克隆菌株進(jìn)行搖菌培養(yǎng)。菌液PCR檢測獲得目的條帶后小提質(zhì)粒并進(jìn)行SacⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，酶切獲得的目的條帶與預(yù)期大小一致，分別為2700 bp和220 bp左右(圖4A)，測序結(jié)果與預(yù)期堿基序列完全一致。將提取的pMD-18-T-BCL2L2-WT陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，用DNA回收試劑盒回收220 bp左右的目的條帶并與PmirGLO載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至DH5α后進(jìn)行抗性篩選，挑取單克隆菌株并進(jìn)行搖菌培養(yǎng)。用DNA小提質(zhì)粒試劑盒提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行SacⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切條帶大小與預(yù)期一致，分別為7360 bp和220 bp左右(圖4B)。將人工合成的BCL2L2-MUT與PmirGLO空載體進(jìn)行SacⅠ、XhoⅠ雙酶切，產(chǎn)物回收后用T4連接酶過夜連接、轉(zhuǎn)化和搖菌培養(yǎng)。提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，檢測結(jié)果顯示目的條帶與預(yù)期大小一致，分別為7 360 bp和230 bp左右(圖4C)。

A.cel-miR-39的實(shí)時(shí)定量；B.cel-miR-39的原始熒光值；C.cel-miR-39的溶解曲線；D.cel-miR-39的RT-qRCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；E.Oar-miR-10b的實(shí)時(shí)定量；F.oar-miR-10b的原始熒光值；G.oar-miR-10b 的溶解曲線；H.oar-miR-10b在不同感染時(shí)期的表達(dá)量

A.Real-time quantification of cel-miR-39; B.The original fluorescence value of cel-miR-39; C.Dissolution curve of cel-miR-39; D.RT-qRCR standard curve for cel-miR-39; E.Real-time quantification of oar-miR-10b; F.The original fluorescence value of oar-miR-10b; G.Dissolution curve of oar-miR-10b; H.Oar-miR-10b expression at different stages of infection

圖2 Oar-miR-10b實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

Fig.2 Real-time qPCR amplification of oar-miR-10b

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.BCL2L2基因片段M.DNA Marker DL 2 000; 1.BCL2L2 gene fragment

2.4 Dual-PmirGLO報(bào)告載體基因熒光強(qiáng)度檢測

分別將構(gòu)建好的PmirGLO-BCL2L2-MUT和PmirGLO-BCL2L2-WT重組質(zhì)粒與Oar-miR-10b mimic和miRNA Negative control根據(jù)分組共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞中，其作用位點(diǎn)見圖5，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行Dual-PmirGLO報(bào)告載體基因熒光檢測。檢測結(jié)果表明，PmirGLO-BCL2L2-WT和oar-miR-10b mimic共轉(zhuǎn)染組與PmirGLO-BCL2L2-WT+miRNA Negative Control共轉(zhuǎn)染對照組相比差異極顯著(P<0.01)，其檢測到的相對熒光強(qiáng)度值下降至對照組的0.58倍(圖6)，而PmirGLO-BCL2L2-MUT和 oar-miR-10b mimic共轉(zhuǎn)染組與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，表明oar-miR-10b可以顯著抑制BCL2L2基因的表達(dá)，同時(shí)也說明BCL2L2是oar-miR-10b的靶基因，其轉(zhuǎn)錄后的翻譯受oar-miR-10b的調(diào)控。

A.pMD-18-T-BCL2L2-WT重組載體雙酶切鑒定的凝膠電泳圖;M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.pMD-18-T-BCL2L2-WT雙酶切;B.PmirGLO-PmirGLO-BCL2L2-WT雙酶切鑒定的凝膠電泳圖;M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；1.PmirGLO-BCL2L2-WT雙酶切;C.PmirGLO-BCL2L2-MUT雙酶切鑒定的凝膠電泳圖;M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；1.PmirGLO-BCL2L2-MUT雙酶切

A.Agarose gel electrophoresis analysis of restriction enzyme digestion of recombinant plasmid pMD-18-T-BCL2L2-WT bySacⅠ andXhoⅠ; M.DNA Marker DL 5 000; 1.Double enzyme digestion of pMD-18-T-BCL2L2-WT;B.Agarose gel electrophoresis analysis of restriction enzyme digestion of recombinant plasmid PmirGLO-PmirGLO-BCL2L2-WT bySacⅠ andXhoⅠ; M.DNA Marker DL 15 000; 1.Double enzyme digestion of PmirGLO-BCL2L2-WT;C.Agarose gel electrophoresis analysis of restriction enzyme digestion of recombinant plasmid PmirGLO-BCL2L2-MUT bySacⅠ andXhoⅠ;M.DNA Marker DL 15 000; 1.Double enzyme digestion of PmirGLO-BCL2L2-MUT

圖4重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

Fig.4 Identification of recombinant plasmids by double enzyme digestion

圖5 oar-miR-10b靶向BCL2L2的作用關(guān)系

3 討論

miRNA是一類長度為19 nt～23 nt的保守核苷酸序列，其可通過結(jié)合到靶基因的mRNA上，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，對增殖、分化、凋亡等基本細(xì)胞過程具有重要的調(diào)控作用。miR-10b作為miRNAs家族中的一員，目前對其的研究多集中于同腫瘤之間的關(guān)系。如已有研究證實(shí)，在食管癌[6]、胰腺癌[7]和鼻咽癌[8]等腫瘤組織中都有異常表達(dá)，主要為miR-10b的上調(diào)，并且這種異常與腫瘤的侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。另有研究表明，抑制miR-10b，降低了T-bet mRNA、RORyt mRNA表達(dá)水平，同時(shí)也降低了IFN-γ和IL-17表達(dá)水平，這說明了抑制miR-10b表達(dá)減弱了TH1和TH17細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[12]。由此可見，miR-10b的上調(diào)可以誘導(dǎo)細(xì)胞癌變，甚至增強(qiáng)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，而下調(diào)則會(huì)引起宿主細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

“WT ”為野生株；“MUT”為突變株

“WT ”wild strain；“MUT”mutant strain

圖6 Oar-miR-10b直接靶向重組載體
PmirGLO-BCL2L2的3′UTR

Fig.6 Direct targeting of BCL2L2 3′UTR by oar-miR-10b
with recombination of PmirGLO vector

探究miRNA的作用機(jī)制，關(guān)鍵是認(rèn)識(shí)miRNA與其靶基因的相互作用關(guān)系。本研究中，通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測并結(jié)合靶基因功能分析，篩選出與細(xì)胞凋亡過程密切相關(guān)的BCL2L2作為miR-10b的候選靶基因。BCL2L2也稱為Bcl-w，是BCL-2蛋白家族的成員，該家族蛋白為一類凋亡過程中重要的調(diào)控因子，包含抗凋亡蛋白(BCL-2、BCL-XL、BCL-W、MCL-1、CED9等)和促凋亡蛋白(Bax、Bak、BCL-XS、Bad、Bik、Bid等)[13]。大量研究證實(shí)，BCL2L2為原癌基因，具有抑制細(xì)胞凋亡的功能，BCL2L2由于與促凋亡成員相互拮抗作用以及它們之間作用的不平衡競爭狀態(tài)導(dǎo)致對細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響，當(dāng)BCL2L2在二聚體中占據(jù)優(yōu)勢時(shí)可以抑制細(xì)胞凋亡起到促進(jìn)細(xì)胞生長的作用[14]。

病毒感染宿主細(xì)胞后往往會(huì)導(dǎo)致兩種結(jié)果：一是通過直接誘導(dǎo)宿主細(xì)胞啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制以限制病毒生長；二是由于病毒蛋白或病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白抑制細(xì)胞凋亡，從而為病毒的繁殖、潛伏感染和后續(xù)的持續(xù)感染創(chuàng)造條件[15]。有研究已報(bào)道，PEDV[10]、EBV[16]和HCMV等病毒感染宿主細(xì)胞后會(huì)上調(diào)BCL2家族基因，進(jìn)而阻斷P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制[17]。本研究用雙熒光素酶報(bào)告載體鑒定BCL2L2與oar-miR-10b的關(guān)系，研究結(jié)果表明，PmirGLO-BCL2L2-WT+oar-miR-10b mimic共轉(zhuǎn)染組與PmirGLO-BCL2L2-WT+miRNA Negative Control共轉(zhuǎn)染對照組相比差異極顯著，初步鑒定出BCL2L2為oar-miR-10b的靶基因，試驗(yàn)結(jié)果提示上調(diào)的BCL2L2基因可能在綿羊痘病毒感染過程中起著重要作用，這為羊痘病毒感染后的繁殖、調(diào)控等機(jī)理研究提供了理論基礎(chǔ)。