天麻鉤藤飲對(duì)腦出血大鼠TLR4、NF-κB和IL-1β表達(dá)的影響

原 鐵，郭永寧，蔡海榮，蔡鑫桂，張為章，陳冬杰，陳伯鈞*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405；3.深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院，廣東深圳 518116)

急性腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指各種原因?qū)е碌哪X實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，ICH是急診科和神經(jīng)科常見的急危重癥，具有發(fā)病急、病情重、致死率高等特點(diǎn)[1]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，我國(guó)ICH發(fā)病率占腦卒中的18.8%～47.6%[2-3]，僅次于缺血性腦卒中，居第2位，1月內(nèi)死亡率高達(dá)35%～52%[4-6]，是我國(guó)居民致殘、致死的最主要原因。腦出血后腦水腫和炎性反應(yīng)是腦出血后繼發(fā)性神經(jīng)損傷的重要原因[7-8]。因此，如何有效地降低腦出血后腦水腫和抑制腦出血后炎性反應(yīng)，是目前研究的熱點(diǎn)。天麻鉤藤飲廣泛應(yīng)用于腦出血患者，具有一定的療效，但是對(duì)其保護(hù)腦神經(jīng)的機(jī)制尚不明確。因此，本試驗(yàn)建立了大鼠腦出血大鼠模型，用天麻鉤藤飲進(jìn)行干預(yù)，觀察了其對(duì)神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦組織含水量和血清Toll樣受體4(TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)和IL-1β表達(dá)水平的影響，探討了天麻鉤藤飲保護(hù)腦出血后神經(jīng)功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只SD健康雄性大鼠，SPF級(jí)，3～4個(gè)月鼠齡，體重250 g～300 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵)2013-0002。

1.1.2 藥品 天麻鉤藤飲(天麻15 g，鉤藤15 g(后下)，石決明30 g(先煎)，梔子15 g，黃芩15 g，川牛膝10 g，杜仲10 g，益母草10 g，桑寄生10 g，夜交藤10 g，茯苓10 g)；將上述中藥飲片加8倍量的水煎煮1 h，再加6倍量的水煎煮1 h，2次藥液過(guò)濾后混合，置100℃環(huán)境濃縮至1 mL相當(dāng)于原藥6 g。

1.1.3 試劑和儀器 大鼠血清TLR4 ELISA試劑盒，上海江萊生物科技有限公司產(chǎn)品；NF-κB ELISA試劑盒，IBL公司產(chǎn)品；IL-1β ELISA試劑盒，Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；大鼠頭顱立體定向儀(ST-5 ND-C)，中國(guó)成都儀器廠生產(chǎn)；微量注射儀，北京博奧森試劑有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴箱(DHG-905385-Ⅲ)，上海新苖醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；HM-200電子天平，日本三洋公司產(chǎn)品；顯微外科手術(shù)器材，上海手術(shù)器械廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 分組和造模 大鼠造模前先適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，待其代謝狀態(tài)穩(wěn)定后隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=20)、模型組(n=20)和天麻鉤藤飲組(n=20)，每組按造模后1、3、5、7 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為4個(gè)亞組，每組5只大鼠。參照段曉春[9]的方法建立腦出血模型：采用100 g/L水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于腦立體定向儀上，暴露顱骨，在前囟點(diǎn)右旁3.5 mm和后0.2 mm交點(diǎn)處，用直徑1 mm的牙科鉆鉆至硬腦膜，經(jīng)靜脈留置針，進(jìn)針至尾狀核，尾動(dòng)脈采血50 μL，先注入10 μL，停針2 min，再緩慢注入40 μL，留針4 min，退針2 cm ,再停針4 min，緩慢出針。縫合切口，消毒。假手術(shù)組與模型組、天麻鉤藤飲組的操作方法相同，但不注血，注入等量的生理鹽水。

1.2.2 給藥方法 天麻鉤藤飲組分別在術(shù)前24 h和術(shù)后予以天麻鉤藤飲18 g/kg·d灌胃，1次/24 h，直至死亡為止。假手術(shù)組和模型組分別在術(shù)前24 h和術(shù)后予以腹腔注射等量生理鹽水，劑量為3 mL/kg·d，1次/24 h，直至死亡為止。

1.2.3 觀察指標(biāo)

1.2.3.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 參照Berderson標(biāo)準(zhǔn)，分別在各術(shù)前和術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。0分：無(wú)體征；1分：動(dòng)物腦部病灶對(duì)側(cè)腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)屈曲，肩內(nèi)收屈曲；2 分：上述體征加上向麻痹側(cè)推阻力下降；3分：活動(dòng)時(shí)向麻痹側(cè)追尾；4分：意識(shí)障礙，無(wú)自發(fā)運(yùn)動(dòng)。

1.2.3.2 腦組織水含量測(cè)定 腦組織水含量(brain water content，BWC)采用干濕比重法，斷頭取大腦前部組織后立即測(cè)濕重(精確到0.10 mg)，然后將同一組織置入恒溫箱中烘干24 h，再秤干重，干濕重量均用電子天平測(cè)量。

BWC(%)=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.2.3.3 血清TLR4、NF-κB、IL-1β表達(dá)水平測(cè)定 分別在試驗(yàn)1、3、5、7 d開胸經(jīng)心臟取血，運(yùn)用ELISA檢測(cè)血清TLR4、NF-κB、IL-1β的水平(由金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司按照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行檢測(cè))。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組1、3、5、7 d各時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能缺損均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，天麻鉤藤飲組1、3、5、7 d各時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能缺損均明顯降低(P<0.05)(表1)。

2.2 各組大鼠腦組織水含量的檢測(cè)結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組1、3、5、7 d各時(shí)間點(diǎn)的腦組織水含量均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，天麻鉤藤飲組1、3、5、7 d各時(shí)間點(diǎn)的腦組織水含量均明顯降低(P<0.05)(表2)。

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，△P<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

表2 各組大鼠腦組織水含量的檢測(cè)結(jié)果

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，△P<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

2.3 各組大鼠血清TLR4、NF-κB、IL-1β的檢測(cè)結(jié)果

假手術(shù)組血清中TLR4、NF-κB、IL-1β表達(dá)水平無(wú)明顯變化，模型組和天麻鉤藤飲組術(shù)后血清TLR4、NF-κB、IL-1β表達(dá)水平均有所升高，均在腦出血后3 d達(dá)到高峰后隨著時(shí)間推移呈不同程度的下降。在術(shù)后1、3、5、7 d各時(shí)間點(diǎn)，模型組血清TLR4、NF-κB、IL-1β表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；天麻鉤藤飲組在術(shù)后1、3、5、7 d各時(shí)間點(diǎn)血清TLR4、NF-κB、IL-1β表達(dá)水平明顯低于模型組(P<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠血清TLR4、NF-κB和IL-1β的檢測(cè)結(jié)果

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，△P<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

3 討論

目前腦出血的機(jī)制尚不完全明確，近年來(lái)炎性反應(yīng)在腦出血的病理生理中的重要性越來(lái)越受到重視。腦出血后腦水腫和炎性反應(yīng)是腦出血后繼發(fā)性神經(jīng)損傷的重要原因。因此，如何有效地降低腦出血后腦水腫和抑制腦出血后的炎性反應(yīng)，可以更好地保護(hù)其神經(jīng)功能。

Toll樣受體(TLRs)是一類重要的天然免疫受體家族一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的有高度保守序列而古老的天然免疫受體家族，其在炎癥反應(yīng)調(diào)控中具有重要的作用，表現(xiàn)在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、促炎癥介質(zhì)合成和釋放、促細(xì)胞成熟和分化等方面[10]。TLR4作為一種具有多種生物活性的跨膜受體，在炎癥反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用，具有促凝血、提高白細(xì)胞黏附能力、增加血管通透性等。已有研究表明，TLR4參與了腦缺血和腦出血后的炎癥反應(yīng)。其導(dǎo)致腦損傷的機(jī)制可能是各種缺血缺氧、氧化應(yīng)激等物質(zhì)刺激TLR4的大量釋放，大量釋放的TLR4作用于神經(jīng)細(xì)胞，并通過(guò)對(duì)NF-κB的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)一步刺激IL-1β等炎癥因子的釋放，促進(jìn)炎癥瀑布反應(yīng)形成，炎癥因子可以刺激白細(xì)胞等釋放更多的炎癥介質(zhì)，形成腦損傷的惡性循環(huán)[11]。NF-κB是一種具有多向性轉(zhuǎn)錄激活功能調(diào)節(jié)分子，其可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)性基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)從而介導(dǎo)炎性反應(yīng)。NF-κB既是TLR4胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路最重要的下游分子，也是促進(jìn)IL-1β等炎癥因子合成和釋放最重要的上游分子。研究表明，腦出血后細(xì)胞外信號(hào)與TLR4結(jié)合后誘導(dǎo)NF-κB活化，NF-κB激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合，通過(guò)對(duì)IL-1β等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使炎癥介質(zhì)過(guò)表達(dá)并最終形成炎癥瀑布反應(yīng)，而IL-1β同時(shí)又是NF-κB的激活劑，因此形成惡性循環(huán)作用，導(dǎo)致持久的炎性反應(yīng)加重神經(jīng)損傷[12]。IL-1β是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，其在機(jī)體炎癥啟動(dòng)、維持和消退中都起著非常重要的作用。研究表明，IL-1β可以通過(guò)與中性粒細(xì)胞表面的受體結(jié)合，增強(qiáng)其毒性，促進(jìn)黏附因子合成和釋放，誘導(dǎo)化學(xué)趨化因子升高，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)聚集到病灶部位，加重炎癥反應(yīng)[13]。還有研究表明，IL-1β可以凋亡而加重腦組織損傷。

腦出血屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，天麻鉤藤飲主要由天麻、鉤藤、石決明、梔子、黃芩、川牛膝、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、茯苓組成，具有平肝熄風(fēng)，清熱活血，補(bǔ)益肝腎之功效的作用[14]。天麻鉤藤飲廣泛應(yīng)用于腦中風(fēng)，具有良好的效果，可以提高臨床有效率、減輕腦水腫，保護(hù)神經(jīng)元等[15]。但是對(duì)天麻鉤藤飲保護(hù)腦出血后神經(jīng)元的機(jī)制尚不完全明確。本試驗(yàn)觀察了天麻鉤藤飲對(duì)腦組織含水量的影響，研究表明，術(shù)后模型組和天麻鉤藤飲組均出現(xiàn)腦組織水腫的現(xiàn)象，術(shù)后3 d達(dá)到高峰后出現(xiàn)不同程度的下降，而天麻鉤藤飲組腦水腫下降的程度明顯優(yōu)于模型組。本試驗(yàn)測(cè)定大鼠血清TLR4、NF-κB、IL-1β的表達(dá)水平，模型組在術(shù)后1、3、5、7 d各時(shí)間點(diǎn)血清TLR4、NF-κB、IL-1β的表達(dá)水平高于假手術(shù)組，天麻鉤藤飲組在術(shù)后1、3、5、7 d各時(shí)間點(diǎn)血清TLR4、NF-κB、IL-1β的表達(dá)水平明顯低于模型組。提示天麻鉤藤飲可能通過(guò)抑制TLR4、NF-κB、IL-1β的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)和減輕腦水腫來(lái)促進(jìn)腦出血后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。

綜上所述，天麻鉤藤飲具有促進(jìn)大鼠腦出血后神經(jīng)功能恢復(fù)的作用，可能與減輕腦水腫和抑制TLR4、NF-κB和IL-1β介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。