桃主要致敏蛋白Pru p 3 T細(xì)胞表位鑒定

鄧 珊，尹 佳，王瑞琦

作者單位： 100730 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)(過敏)反應(yīng)科，過敏性疾病精準(zhǔn)診療研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

桃是我國(guó)成人食物過敏中較常見的致敏食物，且桃過敏反應(yīng)常見于蒿花粉癥患者中，是蒿花粉相關(guān)食物過敏最常見形式。桃過敏患者除了有局部接觸部位蕁麻疹、口腔黏膜變態(tài)反應(yīng)綜合征(oral allergy syndrome, OAS)外，還會(huì)發(fā)生嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)。曾有研究發(fā)現(xiàn)，在907例嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)患者中，由進(jìn)食蔬菜/水果導(dǎo)致的嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)占33%，其中桃是最常見的致敏食物。在桃誘發(fā)的嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)中，71%患者并發(fā)蒿花粉癥[1]。筆者前期研究已鑒定出蒿花粉相關(guān)桃過敏反應(yīng)的主要致敏蛋白為Pru p 3，是相對(duì)分子質(zhì)量為9 000的磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(lipid transfer protein，LTP)，由91個(gè)氨基酸組成。約90%的蒿花粉相關(guān)桃過敏患者血清中存在Pru p 3 特異性IgE(specific IgE，sIgE)[2]。桃Pru p 3與蒿Art v 3(LTP)存在交叉反應(yīng)，目前認(rèn)為Art v 3是引起我國(guó)桃過敏反應(yīng)的初始致敏蛋白[3-4]。

植物來源的LTP是相對(duì)分子質(zhì)量約為9 000的蛋白質(zhì)家族(90～95個(gè)氨基酸組成)，廣泛分布于花粉和植物類食物中，其主要功能是參與植物對(duì)外來病原微生物的免疫防御反應(yīng)，當(dāng)有病原體入侵時(shí)LTP表達(dá)量增加[5]。LTP具有耐加熱和胃蛋白酶消化的特性，因此增加了其致敏性和引發(fā)嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[6-8]。Pru p 3是最具有代表性的LTP分子。Pasquato等于2005年首次報(bào)道了Pru p 3 三維晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其呈高度可塑性的非對(duì)稱性結(jié)構(gòu)，中間包含一個(gè)可結(jié)合多個(gè)磷脂配體的空腔。這個(gè)結(jié)構(gòu)基序由4個(gè)α螺旋構(gòu)成，中間連接2個(gè)短環(huán)和4個(gè)二硫鍵，在分子的外部是3個(gè)高度保守的氨基酸序列。突變分析結(jié)果顯示，隨著氨基酸的插入，該區(qū)域的IgE結(jié)合能力會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。當(dāng)插入3個(gè)氨基酸后，與IgE結(jié)合的能力將明顯下降。目前的研究發(fā)現(xiàn)Pru p 3是可被sIgE識(shí)別的區(qū)域[9]，而且Pru p 3已被重組表達(dá)并用于臨床診斷[10]。國(guó)外也有一些關(guān)于Pru p 3 T細(xì)胞表位的研究報(bào)道[11-12]，但由于國(guó)外大多數(shù)桃過敏反應(yīng)的初始致敏蛋白來源于桃，尤其地中海地區(qū)國(guó)家桃過敏患者常不并發(fā)花粉癥[13]，而在我國(guó)蒿花粉Art v 3被認(rèn)為是引起桃過敏的交叉反應(yīng)致敏蛋白[4]。同時(shí)由于種族和地域性差異，目前尚不清楚Pru p 3引起我國(guó)蒿花粉相關(guān)桃過敏反應(yīng)的T細(xì)胞表位。Pru p 3 T細(xì)胞表位的確定為研究桃過敏反應(yīng)的免疫學(xué)機(jī)制提供了重要信息，同時(shí)可以幫助發(fā)現(xiàn)與其有交叉反應(yīng)的其他食物或花粉變應(yīng)原的相關(guān)表位。主要T細(xì)胞表位的確定為將來利用T細(xì)胞表位合成的肽段對(duì)食物過敏患者進(jìn)行特異性免疫治療提供了理論基礎(chǔ)。本研究以蒿花粉相關(guān)桃過敏患者和健康對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)作為效應(yīng)細(xì)胞，觀察其在Pru p 3 重疊肽段激活下的增生反應(yīng)，對(duì)Pru p 3的主要T細(xì)胞表位進(jìn)行初步研究，探討可能參與蒿花粉和桃變應(yīng)原交叉反應(yīng)的T細(xì)胞表位。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

納入蒿花粉相關(guān)桃過敏患者20例和健康對(duì)照者10例。桃過敏患者中男性6例，女性14例；健康對(duì)照者中男性5例，女性5例。蒿花粉相關(guān)桃過敏(以下簡(jiǎn)稱桃過敏)患者來自北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科門診就診患者，需同時(shí)滿足以下入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)有夏秋季鼻炎和/或哮喘病史，同時(shí)蒿花粉提取物皮內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果≥“++”和蒿sIgE>3.5 kUA/L；(2)有明確進(jìn)食桃2 h內(nèi)出現(xiàn)全身皮膚風(fēng)團(tuán)樣皮疹、口腔黏膜水腫、呼吸困難、惡心、腹痛，甚至變應(yīng)性休克的病史；(3)血清sIgE檢測(cè)結(jié)果顯示Pru p 3 sIgE陽(yáng)性、Pru p 1和Pru p 4 sIgE均陰性。

1.2 方法

1.2.1 血清特異性IgE檢測(cè)：采用ImmunoCAP法測(cè)定受檢者蒿花粉及桃血清sIgE水平，同時(shí)檢測(cè)桃組分Pru p 1、Pru p 3和Pru p 4 sIgE水平(Thermo Fisher Scientific, Uppsala, Sweden)。血清sIgE>0.35 kUA/L判斷為陽(yáng)性。

1.2.2 Pru p 3多肽合成和純化：利用多肽合成儀采用固相合成法合成8條覆蓋Pru p 3.0101全部氨基酸序列的肽段，每條肽段之間重疊5個(gè)氨基酸殘基(Invitrogen, Calif, USA)。8條肽段序列如下：P1(Pru p 31-16): ITCGQVSSALAPCIPY；P2(Pru p 312-27): PCIPYVRGGGAVPPAC；P3(Pru p 323-38): VPPACCNGIRNVNNLA；P4(Pru p 334-49): VNNLARTTPDRQAACN；P5(Pru p 345-60): QAACNCLKQLSASVPG；P6(Pru p 356-71): ASVPGVNPNNAAALPG；P7(Pru p 367-82): AALPGKCGVHIPYKIS；P8(Pru p 378-91): PYKISASTNCATVK。合成肽段存儲(chǔ)于DMSO中(10 mg/ml)，使用前用PBS稀釋至1 mg/ml，加入細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.2.3 PBMC增生試驗(yàn)：將新鮮分離的PBMC用含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺和10 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸溶液(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonicacid，HEPES)RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml。加入96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別加入8條肽段作為刺激物(5 μg/ml)，同時(shí)設(shè)置PHA為陽(yáng)性對(duì)照孔和不加任何刺激物的陰性對(duì)照孔。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下孵育5 d，然后向各孔中加入20 μl CCK-8溶液。37 ℃、5% CO2條件下孵育5 h，測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm處的吸光度(A)值。淋巴細(xì)胞增生水平以刺激指數(shù)(stimulation index，SI)表示，SI=變應(yīng)原刺激后A450值/陰性對(duì)照A450值。SI≥2為結(jié)果陽(yáng)性。

1.2.4 T細(xì)胞表位篩選：將20例桃過敏患者和10例健康對(duì)照的PBMC分別與8條Pru p 3來源的肽段共同孵育，比較桃過敏患者和正常對(duì)照PBMC增生后的SI，分析不同肽段的變應(yīng)原性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(SPSS I，Chicago，IL，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較蒿花粉相關(guān)桃過敏患者和健康對(duì)照PBMC受Pru p 3來源各肽段刺激后的增殖水平。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況

20例桃過敏患者年齡6～46歲，平均(25.7±11.6)歲，其中男性患者6例，占30%。患者中有季節(jié)性哮喘者9例，占45%；患有季節(jié)性鼻炎癥狀者16例，占80%；同時(shí)有鼻炎和哮喘癥狀者6例，占30%?；颊咛疫^敏癥狀僅表現(xiàn)為OAS者4例，占20%；表現(xiàn)為全身反應(yīng)者16例，占80%。20例蒿花粉相關(guān)桃過敏患者的基本情況、臨床表現(xiàn)及血清sIgE水平見表1。

2.2 T細(xì)胞表位篩選結(jié)果

桃過敏患者PBMC對(duì)8條肽段表現(xiàn)出不同的增生能力：肽段Pru p 367-82對(duì)桃過敏患者PBMC的活化程度最高，20例桃過敏患者中對(duì)該肽段SI陽(yáng)性者14例，占70%；Pru p 323-38對(duì)桃過敏患者PBMC的活化率為55%(11/20)；其他各肽段的增生陽(yáng)性率為10%～35%(圖1，表2)。健康對(duì)照者PBMC在各肽段刺激下的增生率為0%～20%，與桃過敏患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

表1 20例蒿花粉相關(guān)桃過敏患者的臨床資料Table 1 Clinical data of patients with mugwort pollen related peach allergy

2.3 參與蒿花粉相關(guān)桃過敏交叉反應(yīng)的潛在T細(xì)胞表位

Pru p 367-82在桃Pru p 3 3D結(jié)構(gòu)中的位置緊鄰以往研究發(fā)現(xiàn)的IgE結(jié)合區(qū)域。比對(duì)Pru p 367-82和蒿花粉組分Art v 3氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，Pru p 367-82與Art v 390-105氨基酸一致率為81%(圖2)。

圖 1 蒿花粉相關(guān)桃過敏患者和健康對(duì)照PBMC在8條來源Pru p 3肽段(P1-P8)作用下增生率Fig 1 Proliferative rate of positive responses of PBMC from peach-allergic patients and control subjects to 8 synthetic peptides (P1-P8) representing the aa sequence of Pru p 3

3 討論

蒿花粉相關(guān)桃過敏反應(yīng)是我國(guó)比較常見的一種食物過敏類型，Pru p 3是蒿花粉相關(guān)桃過敏反應(yīng)的主要致敏蛋白。雖然以往有文獻(xiàn)報(bào)道Pru p 3的T細(xì)胞表位，但由于蒿花粉Art v 3是引起我國(guó)桃過敏的初始致敏蛋白，與國(guó)外多數(shù)桃過敏反應(yīng)發(fā)生機(jī)制有所不同，如地中海地區(qū)國(guó)家中桃過敏患者并不伴有花粉癥。因此，導(dǎo)致我國(guó)蒿花粉相關(guān)桃過敏反應(yīng)發(fā)生的Pru p 3 T細(xì)胞表位尚不清楚。明確Pru p 3特異性的T細(xì)胞表位有助于更深入了解該變應(yīng)原的免疫學(xué)特性，為研究食物過敏發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制提供重要信息。此外，通過研究花粉-食物過敏綜合征中食物變應(yīng)原的T細(xì)胞表位有助于發(fā)現(xiàn)潛在的參與花粉-食物之間交叉反應(yīng)的T細(xì)胞表位[14]。

變應(yīng)原特異性免疫治療是治療變態(tài)反應(yīng)性疾病唯一有效的方法[15]。目前應(yīng)用低變應(yīng)原性的免疫制劑降低了其與IgE的結(jié)合能力，有望成為特異性好、更安全、更有效的治療方法[16-17]。CD4+T淋巴細(xì)胞不僅參與Ⅰ型超敏反應(yīng)[18]，還誘導(dǎo)免疫耐受，在特異性免疫治療中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，在疫苗接種過程中，典型的Th2型免疫反應(yīng)逐漸向Th1型轉(zhuǎn)化，以及生成調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，最終抗原特異性的Th2型免疫反應(yīng)受到抑制[19-20]，而且T細(xì)胞表位肽段僅作用于T淋巴細(xì)胞，不會(huì)活化肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞[21-22]，避免治療中發(fā)生嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，基于T細(xì)胞表位的肽段免疫治療非常有前景。因此，明確桃主要致敏蛋白Pru p 3 的主要T細(xì)胞表位有望用于桃過敏的特異性免疫治療。

表2 蒿花粉相關(guān)桃過敏患者PBMC在P1-P8肽段刺激下細(xì)胞增生水平Table 2 PBMCs from 20 peach-allergic patients stimulated by 8 overlapping peptides representing the aa sequence of Pru p 3(SI)

圖 2 蒿花粉組分Art v 3氨基酸序列以及潛在的參與蒿花粉-桃交叉反應(yīng)的T細(xì)胞表位Fig 2 Amino acid sequence of mugwort Art v 3 and its potential epitope cross-reacting with Pru p 3

本研究分析Pru p 3單致敏的蒿花粉相關(guān)桃過敏患者PBMC增生情況，對(duì)Pru p 3 主要T細(xì)胞表位進(jìn)行初步鑒定。通過比較8條覆蓋Pru p 3分子全部氨基酸序列的合成肽段活化后的桃過敏患者PBMC增生水平，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)活化率較高的T細(xì)胞表位：Pru p 367-82是主要T細(xì)胞表位，70%桃過敏患者T細(xì)胞能識(shí)別該表位，發(fā)生增生反應(yīng)；而另一T細(xì)胞表位Pru p 323-38活化55%桃過敏患者外周血PBMC。值得注意的是，這兩個(gè)T細(xì)胞表位均位于Pru p 3分子3D結(jié)構(gòu)中IgE結(jié)合區(qū)域附近，即Pru p 367-82與Pacios等[23]報(bào)道的IgE構(gòu)象表位存在序列重合，而Pru p 323-38包含了一個(gè)IgE表位區(qū)域(Pru p 323-36)[9]。本研究結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道的T細(xì)胞表位Pru p 365-80和Pru p 361-75有相同的氨基酸序列[24-25]。近來研究發(fā)現(xiàn)，Art v 3是引起我國(guó)桃過敏的交叉反應(yīng)致敏蛋白。本研究比對(duì)了Pru p 367-82和Art v 390-105氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)81%氨基酸殘基一致，因此推測(cè)Pru p 367-82可能是參與蒿花粉-桃交叉反應(yīng)的T細(xì)胞表位，當(dāng)然這個(gè)結(jié)果還需要細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，健康對(duì)照者在Pru p 3各肽段的刺激下也有部分PBMC發(fā)生了細(xì)胞增生。以往文獻(xiàn)報(bào)道，某些變應(yīng)原，如Art v 1和Fel d 1 T細(xì)胞表位可以同時(shí)活化變態(tài)反應(yīng)患者和健康人的T淋巴細(xì)胞，但檢測(cè)其分泌的細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)，健康對(duì)照組細(xì)胞上清干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)/白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)高于變態(tài)反應(yīng)患者組[26-27]。這表明變態(tài)反應(yīng)患者外周血T細(xì)胞在變應(yīng)原刺激下發(fā)生活化和增生，分泌Th2型細(xì)胞因子，而無變態(tài)反應(yīng)的正常T細(xì)胞在變應(yīng)原作用下主要發(fā)生Th1型免疫反應(yīng)。這就解釋了為什么健康對(duì)照者PBMC在Pru p 3肽段的刺激下也發(fā)生增生反應(yīng)的現(xiàn)象。

本研究是首個(gè)在中國(guó)蒿花粉相關(guān)桃過敏患者中針對(duì)桃主要致敏蛋白T細(xì)胞表位的研究，發(fā)現(xiàn)Pru p 323-38和Pru p 367-82是引起我國(guó)蒿花粉相關(guān)桃過敏反應(yīng)的主要T細(xì)胞表位，但這只是一個(gè)初步研究，還需要進(jìn)一步采用Pru p 3特異性的T細(xì)胞系和T細(xì)胞克隆進(jìn)行T細(xì)胞表位的鑒定。明確Pru p 3致敏發(fā)生的關(guān)鍵T細(xì)胞表位將有助于更深入地研究蒿花粉相關(guān)桃過敏交叉反應(yīng)發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制，同時(shí)基于T細(xì)胞表位的肽段免疫治療是特異性免疫治療的趨勢(shì)，明確Pru p 3主要T細(xì)胞表位為將來肽段免疫治療用于臨床奠定了基礎(chǔ)。