校園周邊熟食中金黃色葡萄球的分離及腸毒素基因檢測

曾寶鋒，蔣敏，王洪志，陳娟，趙燕英，唐俊妮

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

金黃色葡萄球菌是一種重要的條件致病菌，廣泛存在于自然界中，污染食品的幾率很大，同時(shí)，金黃色葡萄球菌在適宜的條件下能夠產(chǎn)生腸毒素，引發(fā)食物中毒，它引起的食物中毒通常占居細(xì)菌性食物中毒的第3位[1,2]。近年來，我國由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也逐漸增多，如2016年蕪湖市的一家燃面館發(fā)生一起食物中毒事件，有3人在進(jìn)食后2～3 h內(nèi)均出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果證實(shí)這是一起由金黃色葡萄球菌及其腸毒素引起的食物中毒事件[3]。歐秀華等[4]從引起食物中毒的牛肉醬標(biāo)本中分離到金黃色葡萄球菌并檢測出腸毒素。李光輝等[5]針對2003～2015年金黃色葡萄球菌食物中毒暴發(fā)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，發(fā)現(xiàn)報(bào)道的金黃色葡萄球菌食物中毒事件86起，累計(jì)發(fā)病2431人，死亡人數(shù)0，并認(rèn)為腸毒素A引起食物中毒事件最多，其次為腸毒素 C。呂國平等[6]對石家莊市2007～2013年金黃色葡萄球菌食物中毒株進(jìn)行分子分型和傳統(tǒng)腸毒素檢測，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)腸毒素sea，seb，sec，sed，see五種類型都有檢出，認(rèn)為食物源毒株可產(chǎn)生多種葡萄球菌腸毒素。蔡華等[7]評估上海市居民食用涼拌菜引起金黃色葡萄球菌腸毒素中毒的風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)現(xiàn)上海市市售涼拌菜中 3.39%（21/620）的樣品可檢出金黃色葡萄球菌，每次食用涼拌菜發(fā)生金黃色葡萄球菌中毒的概率為0.04%，每年可能的患病例數(shù)為51.81萬例。國譯丹等[8]分析 2010～2016年從云南省16個(gè)地州市農(nóng)貿(mào)市場、超市及酒店餐館采樣并監(jiān)測14大類食品23723份，檢出金黃色葡萄球菌675株，檢出率為2.85%，其中，肉與肉制品、速凍米面制品、餐飲食品污染金黃色葡萄球菌較為嚴(yán)重。從上述研究可以看出金黃色葡萄球菌極易污染各類食品，并且金黃色葡萄球菌的污染主要是由食品原料本身帶菌以及食品在加工過程中由操作人員而引起[9]。

為了解校園周邊熟食中金黃色葡萄球菌的污染情況，本研究采集校園周邊食品市場及周邊攤點(diǎn)熟食進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離鑒定，并針對菌株攜帶的21種腸毒素基因進(jìn)行檢測。目的是為了了解校園周邊熟食中金黃色葡萄球菌的污染及其腸毒素基因的分布情況，研究結(jié)果為校園周邊金黃色葡萄球菌引起的食品安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基、試劑、菌株

7.5%的NaCl肉湯、Baird-Parker（BP）瓊脂基礎(chǔ)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（trypticase soy broth, TSB），均購自海博生物技術(shù)有限公司；TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCL，1 mmol/L pH 8.0乙二胺四乙酸）購自大連TaKaRa 公司；2×PCR Master Mix、DL 2000 DNA Marker，均購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；金黃色葡萄球菌ATCC6538作為參考菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf 5804R型冷凍離心機(jī)，購自Eppendorf生命科技公司；PTC-200 PCR儀、Versadoc 2000凝膠成像儀，均購自美國Bio-Rad公司；DYY-6C電泳儀，購自北京六一儀器廠；HZQ-F160全溫震蕩培養(yǎng)箱，購自上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

16S rDNA引物以及21種金黃色葡萄球菌腸毒素基因引物參考王瓊等[10]。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 食品樣品的采集與分離純化

樣品采集時(shí)間為2016年夏季（4～7月），在校園周邊農(nóng)貿(mào)市場共采集食品熟食樣品57份，路邊小攤共采集食品熟食樣品32份，合計(jì)89份。

每份樣品約100 g左右，放入無菌采樣袋中，送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離。所有食品樣品均按照

GB4789.10《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》進(jìn)行操作[11]。分離的菌株于-80 ℃超低溫甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 DNA提取

參照Kalia等[12]和Tang等[13]的方法提取樣本的DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 金黃色葡萄球菌的16S rDNA測序鑒定

以提取的DNA為模板，以16S rDNA的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)對照。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：20 μL總反應(yīng)體系：10 μL 2×PCR Master Mix，上下游引物各0.4 μL，DNA 模板1 μL，補(bǔ)水至20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；進(jìn)入PCR循環(huán)，95 ℃變性40 s，55 ℃ 退火50 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測和送樣測序，樣品測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.7 腸毒素基因的PCR檢測

參考王瓊等[10]對金黃色葡萄球菌的腸毒素基因進(jìn)行PCR擴(kuò)檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳和成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測，并記錄結(jié)果。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品采集和細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果

圖1 部分菌株16S rDNA的PCR檢測結(jié)果Fig.1 The 16S rDNA PCR detection results for partial S. aureus strains

2016年4～7月，在校園周邊的農(nóng)貿(mào)市場及路邊小攤共采集食品樣品89份，樣品采樣來源和采樣時(shí)間詳見表 1。分離的金黃色葡萄球菌在選擇性分離培養(yǎng)基Baird-Parker平板上菌落形態(tài)為灰黑色、周圍有渾濁帶、邊緣為淡色、外層有透明帶，比較好辨認(rèn)，革蘭染色也驗(yàn)證分離菌株為革蘭陽性，并且在顯微鏡下呈圓形，葡萄串狀。進(jìn)一步對分離菌株進(jìn)行 16S rDNA的特異性PCR檢測（圖1）和序列比對分析，最終確認(rèn)獲得 71株金黃色葡萄球菌。樣品總的分離率為79.78%（71/89），其中，農(nóng)貿(mào)市場分離46株，分離率為80.7%（46/57）；路邊小攤分離25株，分離率為78.1%（25/32）；金黃色葡萄球菌在不同類別食品中的分離率見表1，由表1可以看出，烘焙食品類樣品共5份，檢出5份，分離率100%；豆類制品共14份，檢出12份，分離率85.7%；袋裝類小食品共7份，檢出6份，分離率85.7%；涼拌菜類共25份，檢出21份，分離率84.0%；米面制品類共18份，檢出15份，分離率83.3%；熟食肉類制品共17份，檢出11份，分離率64.7%；水果類2份未分離出；辣椒面只有1份樣品，從中分離出1株細(xì)菌?？梢?，校園周邊食品樣品中，金黃色葡萄球菌的分離率較高，大多數(shù)食品為即食食品，存在食品不安全隱患。

表1 金黃色葡萄球菌分離菌株樣品來源、種類、采樣時(shí)間及分離結(jié)果Table 1 the sampling sources, types, time, and isolation results of S. aureus

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7.12 雞爪 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-43涼拌菜類（共25份，檢出21份，分離率84.0%）米面制品類（共18份，檢出15份，分離率83.3%）7.12 豬大腸 農(nóng)貿(mào)市場 - -7.15 鹵雞爪 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-57 7.17 鴨肝 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-61 7.17 鹵肉 農(nóng)貿(mào)市場 - -7.17 宮保雞丁 農(nóng)貿(mào)市場 - -7.19 熟豬腸 農(nóng)貿(mào)市場 - -7.19 鹵雞爪 農(nóng)貿(mào)市場 - -7.22 鹵雞爪 路邊小攤 - -4.14 涼拌筍 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-11 4.24 涼拌蓮藕 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-20 4.24 涼拌海帶 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-21 4.24 拌土豆絲 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-22 4.24 涼拌花菜 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-25 5.08 黃瓜絲 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-30 5.08 豌豆泥 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-35 5.08 涼菜 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-36 7.12 豌豆泥 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-40 7.12 涼拌筍 農(nóng)貿(mào)市場 - -7.12 涼拌海帶 路邊小攤 - -7.12 涼拌海帶 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-47 7.15 涼拌藕 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-50 7.15 豌豆泥 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-52 7.15 涼拌豆角 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-53 7.15 涼拌蕨菜 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-54 7.15 涼拌粉絲 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-55 7.15 海帶絲 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-58 7.15 涼拌竹筍 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-59 7.17 涼拌絲瓜 農(nóng)貿(mào)市場 - -7.17 涼拌辣椒 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-62 7.19 涼拌筍 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-65 7.22 腌筍絲 路邊小攤 + SA-16-68 7.22 腌菜絲 路邊小攤 + SA-16-70 7.22 蘿卜絲 農(nóng)貿(mào)市場 - -4.08 肉餡包子 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-2 4.08 涼粉 路邊小攤 + SA-16-3 4.12 壽司 路邊小攤 + SA-16-9 4.14 梅干菜薄餅 路邊小攤 + SA-16-14 4.16 雞蛋餅 路邊小攤 + SA-16-18 4.24 涼皮 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-24 4.24 蔥油餅 路邊小攤 - -5.08 薄餅 路邊小攤 + SA-16-28 5.08 雞蛋皮 農(nóng)貿(mào)市場 + SA-16-37

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注：“+”代表分離出金黃色葡萄球菌，“-”代表未分離出金黃色葡萄球菌。

2.2 金黃色葡萄球菌分離菌株腸毒素基因檢測結(jié)果

圖2 金黃色葡萄球菌分離菌株腸毒素基因的檢出情況Fig.2 the detection results of staphylococcal enterotoxin genes of S. aureus food isolates

針對腸毒素基因的詳細(xì)檢出結(jié)果見表2。PCR檢測結(jié)果表明：分離的71株金黃色葡萄球菌中，有46株分離菌株檢出攜帶腸毒素基因，攜帶腸毒素基因菌株的檢出率為64.78%（46/71）。由表2可見，攜帶1種腸毒素基因型的共有23株分離菌株；攜帶2種腸毒素基因型的共7株；攜帶3種腸毒素基因型的有1株分離菌株；攜帶4種腸毒素基因型的有1株分離菌株；攜帶5種腸毒素基因型的有4株分離菌株；還有4株分離菌株同時(shí)攜帶6種腸毒素基因；3株分離菌株攜帶7種腸毒素基因；1株分離菌株攜帶8種腸毒素基因；2株菌株攜帶11種腸毒素基因。

21種腸毒素基因中，共有15種基因被檢出（詳見圖2），包括3種傳統(tǒng)腸毒素基因和12種新型腸毒素基因，其中，sex有40株檢出，檢出率最高，為86.96%（40/46）；sei和sem各有15株檢出，檢出率為32.61%（15/46）；seo和sen各有14株檢出，檢出率為30.43%（14/46）；set有10株檢出，檢出率為21.74%（10/46）；seg有6株檢出，檢出率為13.04%（6/46）；sea、seb、ser各有5株檢出，檢出率為10.87%（5/46）；sej、seu各有3株檢出，檢出率為6.52%（3/46）；sek、seq各有2株檢出，檢出率為4.34%（2/46）；sed有1株檢出，檢出率為2.17（1/46）%；腸毒素基因sec、see、seh、sel、sep和ses未檢出。校園周邊熟食分離的金黃色葡萄球菌中腸毒素基因的攜帶率較高。

表2 金黃色葡萄球菌食品分離菌株腸毒素基因分布及類型Table 2 The distribution of enterotoxin genes in S. aureus food isolates

3 結(jié)論

3.1 近幾年，有很多關(guān)于金黃色葡萄球菌食物中毒的報(bào)道，由金黃色葡菌腸毒素引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌食物中毒的33%～45%[14,15]。金黃色葡萄球菌在食物中的污染率也較高，雷云瑞等[16]在54份樣品中的檢出率達(dá)42.6%；苑學(xué)霞[17]在130份生牛乳中樣品中的檢出率為43.85%。本研究從校園周邊市場和小攤販采集的89份食品中，污染率高達(dá)79.78%。其中，烘焙食品及糕點(diǎn)樣品的污染率為100%；豆類制品、袋裝類小食品、涼拌菜類、米面制品、熟食肉類等的污染率也較高。另外，農(nóng)貿(mào)市場采樣的污染率為80.7%；路邊小攤采樣的污染率為78.1%，農(nóng)貿(mào)市場和路邊小攤的污染率較為接近。我們的研究結(jié)果高于其他報(bào)道，分析原因可能與采樣時(shí)間、采樣種類以及樣品所處環(huán)境有關(guān)。采樣時(shí)間是在夏季，采樣種類大多為熟食即食食品。校園周邊熟食中金黃色葡萄球菌的污染率較高。因此，應(yīng)加強(qiáng)對校園周邊食物中金黃色葡萄球菌的污染調(diào)查。

3.2 另一方面，由于腸毒素可引起食物中毒，研究腸毒素基因在金黃色葡萄球菌中的分布也非常重要。目前發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌腸毒素有許多不同的血清型[18,19]。從現(xiàn)有的報(bào)道可以看出，金黃色葡萄球菌腸毒素基因的檢出率可高達(dá)93.5%[20]。顧其芳等[21]從上海地區(qū)生牛乳中分離的金黃色葡萄球菌攜帶腸毒素基因的陽性率達(dá)53.1%；劉思超等[22]從惠州市熟肉制品中分離的金黃色葡萄球菌攜帶腸毒素基因的陽性率達(dá)41.16%。本研究中，我們共檢測了21種腸毒素基因，檢出了15種不同類型的腸毒素基因。71株菌株有46株分離菌株攜帶腸毒素基因，攜帶腸毒素基因菌株的檢出率為64.78%，攜帶兩種及兩種以上腸毒素基因的菌株占50%（23/46）。傳統(tǒng)腸毒素基因檢出sea、seb和sed。新型腸毒素基因中，sex、sei、sem、seo、sen檢出率較高，其中sex檢出率最高為86.96%（40/46）。齊歡歡等[23]對內(nèi)蒙古地區(qū)乳源金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果也顯示新型腸毒素基因檢出率高于傳統(tǒng)腸毒素基因。McLauchlin等[24]調(diào)查引起食物中毒的23株金黃色葡萄球菌，沒有檢測到傳統(tǒng)腸毒素基因，但每株菌都攜帶一種或者多種新型腸毒素基因。黃嘉慧等[25]從我國39個(gè)城市采集市售食用菌樣本，其中分離的金黃色葡萄球菌也發(fā)現(xiàn)新型腸毒素基因檢出率高。另外，Becker等[26]研究了人血液和人鼻腔分離出的429株金黃色葡萄球菌的腸毒素基因分布情況，以及Akineden等[27]對患乳腺炎奶牛產(chǎn)的牛奶中分離的103株金黃色葡萄球菌的腸毒素基因進(jìn)行檢測，都顯示新型腸毒素檢出率較高，與本研究結(jié)果具有一致性。這些結(jié)果表明新型腸毒素可能對人體健康同樣具有潛在威脅[28]。因此，未來應(yīng)加強(qiáng)對新型腸毒素致病性研究。

3.3 進(jìn)一步從單個(gè)菌株攜帶腸毒素基因種類來分析，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌株具有不同的腸毒素基因型，從另一個(gè)側(cè)面也反映了菌株的遺傳背景多樣性。23株菌株攜帶兩種及以上的腸毒素基因，有4株菌株甚至攜帶6種腸毒素基因；3株菌株攜帶7種腸毒素基因；1株分離菌株攜帶8種腸毒素基因；2株分離菌株攜帶11種腸毒素基因。說明食物源金黃色葡萄球菌毒株可產(chǎn)多種類型葡萄球菌腸毒素，并且腸毒素基因在不同食物源毒株中的分布具有多樣性。本研究的缺陷是未對菌株進(jìn)行分子分型，以后的工作應(yīng)加強(qiáng)這方面的研究。

3.4 綜上，通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)校園周邊熟食中金黃色葡萄球菌分離率和腸毒素基因攜帶率較高，新型腸毒素基因檢測率高于傳統(tǒng)腸毒素基因型，研究結(jié)果為金黃色葡萄球菌食品安全提供參考依據(jù)。