納豆菌發(fā)酵扇貝裙邊制備ACE抑制肽的工藝優(yōu)化

高潔，高翔，于佳，魏玉西，焦奎，張雪梅，王金梅，李鈺金

(1.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266071)

(2.榮成泰祥食品股份有限公司，山東省冷凍調(diào)理食品加工技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東榮成 264309)

高血壓疾病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性病之一，也是世界范圍內(nèi)的常見病，其危害僅次于腫瘤，被認(rèn)定為“生命第一殺手”[1,2]。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)顯示，世界各國(guó)高血壓平均發(fā)病率為10%～20%，全球每年因高血壓死亡的人數(shù)達(dá)1200萬(wàn)[3]，在我國(guó)高血壓患者已超過1.6億人[4]。

目前，化學(xué)合成的降血壓藥物如賴諾普利、卡托普利等雖然對(duì)治療高血壓具有一定的療效，但往往會(huì)引起咳嗽、味覺失調(diào)、皮疹、頭痛等副作用[5～7]。因而尋找一種安全、無(wú)副作用的食物源 ACE抑制肽替代傳統(tǒng)的降壓藥物變得十分迫切。

扇貝屬軟體動(dòng)物門、瓣腮綱、珍珠貝目(Pterioida)、扇貝科(Pectinidae)，被譽(yù)為海產(chǎn)八珍之一，是國(guó)際上公認(rèn)的高檔水產(chǎn)品[8,9]。近幾十年來(lái)，我國(guó)扇貝養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，主要養(yǎng)殖品種為櫛空扇貝、海灣扇貝和蝦夷扇貝，在規(guī)模和產(chǎn)量上均居世界第一位，而扇貝加工過程中產(chǎn)生的下腳料亦因量大、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等原因引起了人們的廣泛關(guān)注[10]。但由于技術(shù)水平的限制，導(dǎo)致大量扇貝裙邊未得到合理有效的利用[11,12]。因此，探討其高值化利用方法與途徑勢(shì)在必行。

納豆菌(Bacillus natto)是從傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆上發(fā)現(xiàn)并分離純化出來(lái)的一種益生菌，屬細(xì)菌科、芽孢桿菌屬，是枯草芽孢桿菌的亞種[13,14]?？莶菅挎呔鷮俚闹匾攸c(diǎn)是能夠分泌各種胞外酶，包括蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶和植酸酶，而納豆菌分泌的酶活性比其它枯草芽孢桿菌分泌酶活性高幾十倍[15,16]。因此，本文將利用納豆菌能夠產(chǎn)生多種蛋白酶的特性，發(fā)酵扇貝裙邊蛋白制備 ACE抑制肽。在前期工作中，已經(jīng)從七種市售納豆產(chǎn)品中分離保藏了一株蛋白酶活性較高的菌株，為本次發(fā)酵扇貝裙邊制備ACE抑制肽的工藝探究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆芽孢桿菌(實(shí)驗(yàn)室分離保藏菌種，菌株保藏號(hào)為M 2018081)；扇貝裙邊：櫛孔扇貝(Chlamys farreri)，于2017年11月購(gòu)自青島市沙子口農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，取出貝柱和扇貝殼，余者即為扇貝裙邊；蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、葡萄糖、碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酪蛋白、酪氨酸、鹽酸、硼酸鹽、氯化鈉 、硼酸、乙酸乙酯、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、碘化鉀等(均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；馬尿酸-組氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、四肽標(biāo)準(zhǔn)品(Gly-Gly-Tyr-Arg)，(美國(guó) Sigma公司)。

1.2 主要方法

1.2.1 扇貝裙邊預(yù)處理

將新鮮櫛孔扇貝裙邊清洗干凈、切碎后置于50 ℃烘箱中干燥，于粉碎機(jī)中粉碎后過100目篩即得扇貝裙邊粉；再將扇貝裙邊粉：95%乙醇按照1:10的比例[W(g)/V(mL)]在60 ℃條件下脫脂處理1 h[17]，晾干，所得脫脂扇貝裙邊粉于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 種子菌懸液的制備

參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行。保存的納豆菌經(jīng)活化后，從斜面上挑1～2環(huán)納豆菌接到LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫?fù)u床180 r/min培養(yǎng)24 h，制得種子菌懸液。

1.2.3 納豆菌生長(zhǎng)曲線的制備

參照文獻(xiàn)[20,21]進(jìn)行，將斜面上的納豆菌接入 LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，以未接種培養(yǎng)基作對(duì)照，每3 h取一次樣于600 nm測(cè)定吸光值(OD)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，結(jié)果取其平均值，繪制納豆菌生長(zhǎng)曲線，找出對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.4 ACE抑制肽的制備工藝

準(zhǔn)確稱取脫脂扇貝裙邊粉2.0 g，加入一定體積蒸餾水，121 ℃滅菌20 min，接種活化后的納豆菌進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后10000 r/min離心10 min，取上清液分別測(cè)多肽含量和 ACE抑制率，每組做三個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

1.2.5 單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)

分別以不同的發(fā)酵溫度(X1)、發(fā)酵時(shí)間(X2)、接種量(X3)、液料比(X4)為單因素，其中發(fā)酵溫度設(shè)置33、37、41、45、49 ℃五個(gè)水平，發(fā)酵時(shí)間設(shè)置24、32、40、48、56 h五個(gè)水平，接種量設(shè)置1%、3%、5%、7%、9%五個(gè)水平，液料比設(shè)置10、15、20、25、30五個(gè)水平，改變其中一個(gè)因素，其他因素保持不變，考察各因素對(duì)發(fā)酵液多肽含量(Y1)和ACE抑制率(Y2)的影響，并以此為指標(biāo)確定影響因素以及其水平的取值范圍。然后采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，并建立二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型得出最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 多肽含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[22,23]進(jìn)行。以Gly-Gly-Tyr-Arg標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，OD540值為縱坐標(biāo)，制作多肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。取2 mL發(fā)酵液，加入2 mL 10% TCA溶液，于旋渦混合器上混合均勻，靜置5 min，然后在3500 r/min下離心15 min，取上清液全部轉(zhuǎn)移至5.0 mL容量瓶中，并用5% TCA定容至刻度，搖勻，然后取3.0 mL上述溶液置于另一管中，加入雙縮脲試劑2.0 mL，于旋渦混合儀上混合均勻，靜置5 min，2000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm處測(cè)定吸光值OD540，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中的多肽濃度c(mg/mL)?？瞻讓?duì)照管加3 mL蒸餾水和2 mL雙縮脲試劑，于旋渦混合器上混合均勻，靜置4 min，2000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm測(cè)定吸光值OD540（對(duì)照）。

1.3.2 多肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

多肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示：回歸方程為y =0.1563x - 0.0022，R2= 0.9994。

圖1 多肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of peptide content

1.3.3 ACE抑制率的測(cè)定

ACE抑制率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[24]進(jìn)行。取100 μL 5.0 mmol/L HHL溶液和40 μL離心后的發(fā)酵物上清液混合，于37℃水浴中保溫10 min，加入0.1 U/mL ACE 20 μL，混勻后于37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)35 min。從水浴鍋中取出，向反應(yīng)體系中加入200 μL 1 mol/L HCl終止反應(yīng)，再加入1.2 mL冷凍乙酸乙酯提取產(chǎn)生的馬尿酸，旋渦震蕩混勻后，以3500 r/min離心5 min，吸取1.0 mL的乙酸乙酯層，在90 ℃烘箱中經(jīng)1 h烘干、冷卻后加入4 mL蒸餾水充分溶解，漩渦混合后于228 nm處測(cè)吸光值OD228。平行對(duì)照管除在反應(yīng)前先加入200 μL 1 mol/L HCl以終止反應(yīng)外，其余操作步驟均同反應(yīng)管，重復(fù)測(cè)定3次結(jié)果取平均值，根據(jù)下列公式計(jì)算發(fā)酵液ACE抑制率。

發(fā)酵液ACE抑制率(%)=(Ab-Aa)/(Ab-Ac)

注：Aa-發(fā)酵液和ACE酶同時(shí)與HHL反應(yīng)的吸光值，Ab-不含發(fā)酵液時(shí)，ACE酶和HHL反應(yīng)的吸光度值，Ac-發(fā)酵液和ACE酶都不存在時(shí)的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2016和Design Expert 8.0.6進(jìn)行繪圖并作方差與顯著性分析，p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆菌生長(zhǎng)曲線

納豆菌生長(zhǎng)曲線見圖2。由圖2可知，納豆菌生長(zhǎng)曲線大致可以分為4個(gè)階段：納豆菌在1～3 h，處于生長(zhǎng)平緩期；3～12 h，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在12～18 h，處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期；21 h后進(jìn)入生長(zhǎng)衰亡期。根據(jù)益生菌一般發(fā)酵培養(yǎng)規(guī)律，細(xì)菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)平衡，菌體內(nèi)酶系活躍，代謝旺盛，群體的形態(tài)與生理特征最一致，且抗不良環(huán)境能力強(qiáng)。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均以培養(yǎng)9 h的納豆菌作為發(fā)酵扇貝裙邊制備ACE抑制肽的種子液。

圖2 納豆菌的生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of Bacillus natto

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)多肽含量和 ACE抑制率的影響

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)多肽含量和ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on peptide content and ACE inhibition rate

不同的發(fā)酵溫度對(duì)多肽含量和 ACE抑制率的影響見圖3。由圖3可知：不同的發(fā)酵溫度對(duì)扇貝裙邊發(fā)酵液中多肽含量和 ACE抑制率有一定的影響。當(dāng)溫度較低時(shí)，納豆菌生長(zhǎng)不佳，代謝能力差，產(chǎn)酶量也較少，而溫度較高時(shí)，導(dǎo)致納豆菌生長(zhǎng)繁殖受到抑制，代謝受到干擾，致使蛋白酶的活性減弱。當(dāng)發(fā)酵溫度在41 ℃時(shí)，發(fā)酵液中多肽含量和ACE抑制率均達(dá)到最大值(分別為197.42 mg/g和76.13%)。因此，選擇41 ℃作為納豆菌發(fā)酵扇貝裙邊制備ACE抑制肽的發(fā)酵溫度。

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多肽含量和 ACE抑制率的影響

不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)多肽含量和 ACE抑制率的影響見圖4。由圖4可知：不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液的多肽含量和ACE抑制率具有顯著的影響。當(dāng)發(fā)酵40 h時(shí)多肽含量和 ACE抑制率均達(dá)到最大值(分別為189.22 mg/g和70.27%)，此后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽含量和 ACE抑制率均降低。這是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行，已經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的部分 ACE抑制肽被蛋白酶分解形成不具有 ACE抑制活性的短肽或游離氨基酸，導(dǎo)致多肽含量和ACE抑制率均降低，該結(jié)果與梁美艷[25]報(bào)道的研究結(jié)果相吻合。因此，納豆菌發(fā)酵扇貝裙邊制備ACE抑制肽的最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間為40 h。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多肽含量和ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of fermentation time on peptide content and ACE inhibition rate

2.2.3 料液比對(duì)多肽含量和 ACE抑制率的影響

圖5 料液比對(duì)多肽含量和ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of material-to-liquid ratio on polypeptide content and ACE inhibition rate

不同的料液比對(duì)多肽含量和 ACE抑制率的影響見圖 5。扇貝裙邊蛋白作為本試驗(yàn)納豆菌發(fā)酵的唯一氮源，一方面可以為納豆菌生長(zhǎng)繁殖提供充足的氮源和碳源，另一方面扇貝裙邊蛋白可被納豆菌分解形成多肽。當(dāng)料液比較低時(shí)，培養(yǎng)基中含水量較少，不利于納豆菌生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)酶相對(duì)較少，導(dǎo)致多肽含量和ACE抑制率都不高，料液比較高時(shí)，稀釋了發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度從而影響了發(fā)酵的速度，產(chǎn)生的多肽較少，導(dǎo)致 ACE抑制率也不高。因此，料液比對(duì)發(fā)酵液中多肽含量和 ACE抑制率具有顯著的影響。當(dāng)料液比為1:20時(shí)，多肽含量和ACE抑制率達(dá)到最高(分別為190.51 mg/g和74.01%)。因此選擇料液比1:20作為納豆菌發(fā)酵扇貝裙邊制備ACE抑制肽的料液比。

2.2.4 接種量對(duì)多肽含量和 ACE抑制率的影響

圖6 接種量對(duì)多肽含量和ACE抑制率的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on polypeptide content and ACE inhibition rate

不同的接種量對(duì)多肽含量和 ACE抑制率的影響見圖6所示。由圖6可知，接種量為5%時(shí)，發(fā)酵液多肽含量和 ACE抑制率均達(dá)到最佳(分別為 187.96 mg/g和59.21%)。這是由于當(dāng)接種量較少時(shí)，產(chǎn)生的蛋白酶量會(huì)較少，導(dǎo)致納豆菌分解扇貝裙邊蛋白產(chǎn)生的多肽含量較少，ACE抑制率較低；當(dāng)接種量過大時(shí)，納豆菌生長(zhǎng)過快，培養(yǎng)基中有限的營(yíng)養(yǎng)條件限制了納豆菌的生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶能力，菌體自溶凋亡，導(dǎo)致多肽含量和 ACE抑制率都不高，常通[26]在對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉仔蛋白制備 ACE抑制肽條件的優(yōu)化研究中也發(fā)現(xiàn)了這個(gè)規(guī)律。因此選擇 5%的接種量作為納豆菌發(fā)酵扇貝裙邊制備ACE抑制肽最佳接種量指標(biāo)。

2.3 響應(yīng)面分析因素及水平

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以多肽含量(Y1)和ACE抑制率(Y2)為響應(yīng)變量，從單因素試驗(yàn)結(jié)果選出4個(gè)因素即發(fā)酵溫度(X1)、發(fā)酵時(shí)間(X2)、接種量(X3)和料液比(X4)進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Response surface test factor levels

2.4 響應(yīng)面結(jié)果及分析

2.4.1 回歸模型的建立和顯著性檢驗(yàn)

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface methodology design and results

表3 多肽含量回歸模型方差分析和方差系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Variance analysis of polypeptide content regression model and variance coefficient significance test

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注：***差異極顯著(p＜0.001)；**差異高度顯著(p＜0.01)；*差異顯著(p＜0.05)。

表4 ACE 抑制率回歸模型方差分析和方差系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Variance analysis of ACE inhibition rate regression model and significance test of variance coefficient

各因素經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合后，得到多肽含量Y1與發(fā)酵溫度X1、發(fā)酵時(shí)間X2、液料比X3、接種量X44個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：

對(duì)回歸方程做顯著性檢驗(yàn)與方差分析，方差分析結(jié)果見表4，結(jié)果顯示：多肽含量模型的F值為11.18，p＜0.0001，說(shuō)明試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性，失擬項(xiàng)p＞0.05，差異不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，實(shí)驗(yàn)誤差主要來(lái)源于隨機(jī)誤差；由統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得出模型的確定系數(shù)R2=0.9179，說(shuō)明此模型擬合度較好，可以用此模型對(duì)多肽含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

一次項(xiàng) X2對(duì)扇貝裙邊發(fā)酵液中多肽含量的影響極顯著，X3影響高度顯著，X1和X4影響顯著；交互項(xiàng)中X2X3影響顯著；二次項(xiàng)中影響極顯著，X42影響高度顯著。同時(shí)由表4中F值的檢驗(yàn)還可知各因素對(duì)多肽含量影響的大小順序?yàn)椋篨2(時(shí)間)＞X3(液料比)＞X4(接種量)＞X1(溫度)。因此，各個(gè)因素對(duì)扇貝裙邊發(fā)酵液中多肽含量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是呈二次關(guān)系。

各因素經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合后，得到多肽含量Y1與發(fā)酵溫度X1、發(fā)酵時(shí)間X2、液料比X3、接種量X44個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：

對(duì)回歸方程做顯著性檢驗(yàn)與方差分析，方差分析結(jié)果見表 5，結(jié)果顯示：ACE抑制率模型的 F值為12 .44，p＜0.0001，說(shuō)明試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性，而且失擬項(xiàng)p＞0.05，差異不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，實(shí)驗(yàn)誤差主要來(lái)源于隨機(jī)誤差；由統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得出模型的確定系數(shù)R2=0.9256，說(shuō)明此模型擬合度較好，能夠很好地描述試驗(yàn)結(jié)果，因此可以用此模型對(duì)發(fā)酵液多肽含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

一次項(xiàng)X2對(duì)扇貝裙邊發(fā)酵液ACE抑制率的影響極顯著，X3和X4影響高度顯著；交互項(xiàng)中X1X4、X3X4影響高度顯著；二次項(xiàng)中影響極顯著，X42影響高度顯著。同時(shí)由表 5中 F值的檢驗(yàn)還可知各因素對(duì)ACE抑制率影響的大小順序?yàn)椋篨2(時(shí)間)＞X3(液料比)＞X4(接種量)＞X1(溫度)。因此，各個(gè)因素對(duì)扇貝裙邊發(fā)酵液ACE抑制率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.4.2 響應(yīng)面分析

2.4.2.1 多肽含量響應(yīng)面結(jié)果分析

Y1模型的時(shí)間與溫度、液料比與溫度、接種量與溫度、料液比與時(shí)間、接種量與時(shí)間、接種量與液料比的兩因素間交互作用對(duì)扇貝裙邊發(fā)酵液中多肽含量的影響見圖7所示。

圖7 多肽含量響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface plot of polypeptide content

由圖7a、7b可知，固定料液比為20，接種量為5%，當(dāng)溫度處于較高水平時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增大多肽含量先急劇升高后平緩降低，當(dāng)發(fā)酵溫度處于較低水平時(shí)，多肽含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增大先急劇升高后平緩降低；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間處于較低水平時(shí)，多肽含量隨著發(fā)酵溫度的升高而降低，變化趨勢(shì)不是很明顯，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間處于較高水平時(shí)，多肽含量隨著發(fā)酵溫度的升高先升高后降低。

由圖7c、7d可知，固定發(fā)酵時(shí)間為40 h，接種量為 5%，當(dāng)料液比處于較低水平時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，多肽含量先升高后降低，升高和降低都很明顯，當(dāng)料液比處于較高水平時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高多肽含量先平緩上升后再急劇下降；當(dāng)發(fā)酵溫度處于較低水平時(shí)隨著液料比的增大，多肽含量先急劇升高后趨于平緩，當(dāng)發(fā)酵溫度處于較高水平時(shí)隨著液料比的增大，多肽含量先升高后降低。

由圖7e、7f可知，固定發(fā)酵時(shí)間為40 h，液料比為20，當(dāng)發(fā)酵溫度處于較低和較高水平時(shí)，隨著接種量的增大，多肽含量先增加后減少，變化幅度不明顯；當(dāng)接種量處于較高或較低水平時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，多肽含量先升高后降低。

由圖7g、7h可知，固定發(fā)酵溫度為41 ℃，接種量為 5%，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間處于較低水平時(shí)，隨著料液比的增大多肽含量先急劇升高后緩慢下降，當(dāng)發(fā)酵溫度處于較高水平時(shí)，隨著液料比的增大多肽含量先升高后降低；當(dāng)液料比處于較低水平時(shí)，隨著多肽含量先急劇升高后緩慢降低，當(dāng)料液比處于中等水平時(shí)，多肽含量處于較高水平。發(fā)酵時(shí)間和液料比之間的交互作用顯著。

由圖7i、7j可知，固定發(fā)酵溫度為41 ℃，料液比為20，當(dāng)接種量處于較低水平時(shí)，多肽含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增大先升高后降低，當(dāng)接種量處于較高水平時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽含量急劇升高后趨于平緩；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間處于較低水平時(shí)，隨著接種量的增大，多肽含量先升高后降低，變化趨勢(shì)不是很明顯，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間處于較高水平時(shí)，隨著接種量的加大多肽含量先升高后趨于平緩。

由圖7k、7l可知，固定發(fā)酵時(shí)間為40 h，發(fā)酵溫度為 41 ℃，當(dāng)接種量處于較低水平時(shí)，隨著料液比的增大多肽含量先升高后降低，當(dāng)接種量處于較高水平時(shí)，隨著料液比的增大多肽含量急劇升高后趨于平緩；當(dāng)料液比處于較低水平時(shí)，隨著接種量的不斷增大，多肽含量先升高后降低，變化趨勢(shì)不是很明顯，當(dāng)料液比處于較高水平時(shí)，隨著接種量的增大多肽含量先升高后趨于平緩。

2.4.2.2 ACE抑制率響應(yīng)面結(jié)果分析

圖8 ACE抑制率響應(yīng)曲面圖Fig.8 ACE inhibition rate response surface map

Y1模型的時(shí)間與溫度、液料比與溫度、接種量與溫度、料液比與時(shí)間、接種量與時(shí)間、接種量與液料比的兩因素間交互作用對(duì)扇貝裙邊發(fā)酵液 ACE抑制率的影響見圖8所示。

由圖8a、8b可知，固定接種量為5%，液料比為20，當(dāng)發(fā)酵溫度處于較低和較高水平時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，ACE抑制率呈先平穩(wěn)不變后下降的趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間處于較高或者較低水平時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高ACE抑制率無(wú)明顯的變化。

由圖8c、8d可知，固定發(fā)酵時(shí)間為40 h，接種量為 5%，當(dāng)發(fā)酵溫度處于較低和較高水平時(shí)，隨著液料比的增大，ACE抑制率先升高后趨于平緩；當(dāng)料液比處于較高和較低水平時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高ACE無(wú)明顯的變化。

由圖8e、8f可知，固定發(fā)酵時(shí)間為40 h，液料比為20，當(dāng)發(fā)酵溫度處于較低水平時(shí)，隨著接種量的增大，ACE抑制率先升高后趨于平緩，當(dāng)發(fā)酵溫度處于較高水平時(shí)，隨著接種量的增大 ACE抑制率先升高后降低，變化趨勢(shì)不明顯；但當(dāng)接種量處于較低和較高水平時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，ACE抑制率先升高后趨于平緩，接種量與發(fā)酵溫度之間的交互作用顯著。

由圖8g、8h可知，固定發(fā)酵溫度為41 ℃，接種量為 5%，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間處于較低水平時(shí)，隨著液料比的增大 ACE抑制率先急劇上升后趨于平緩，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間處于較高水平時(shí)，隨著液料比的增大 ACE抑制率先升高后降低，變化幅度不明顯；當(dāng)液料比處于較低水平時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，ACE抑制率逐漸升高后降低，當(dāng)液料比處于較高水平時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，ACE抑制率變化幅度不明顯。

由圖8i、8j可知，固定發(fā)酵溫度為41 ℃，液料比為20，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間處于較低水平時(shí)，隨著接種量的增大 ACE抑制率先平緩升高后降低，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間處于較高水平時(shí)，隨著接種量的增大 ACE抑制率先急劇升高后降低；當(dāng)接種量處于較高或者較低水平時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，ACE抑制率先升高后降低，變化趨勢(shì)不是很明顯。

由圖8k、8l可知，固定發(fā)酵時(shí)間為40 h，發(fā)酵溫度為 41 ℃，當(dāng)接種量處于較低水平時(shí)，隨著液料比的增大，ACE抑制率先升高后降低，變化趨勢(shì)不是特別明顯，當(dāng)接種量處于較高水平時(shí)，隨著液料比的增大，ACE抑制率先急劇升高后趨于平緩；當(dāng)液料比處于較低水平時(shí)，隨著接種量的不斷增大 ACE抑制率先升高后降低，當(dāng)料液比處于較高水平時(shí)，隨著接種量的不斷加大 ACE抑制率先急劇升高后降低。接種量和液料比之間的交互作用顯著。

2.4.3 最優(yōu)發(fā)酵工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)可以得到納豆菌發(fā)酵扇貝裙邊制備 ACE抑制肽的最佳工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間38.38 h，發(fā)酵溫度39.78 ℃，接種量6.08%，液料比22.45。在此最佳發(fā)酵條件下，多肽含量和ACE抑制率的理論值是203.70 mg/g和82.22%。為方便操作，將發(fā)酵條件設(shè)定為：發(fā)酵時(shí)間 38.4 h，發(fā)酵溫度39.8 ℃，接種量6.0%，液料比22.5。在此發(fā)酵條件下，多肽含量高達(dá)238.91 mg/g，ACE抑制率達(dá)到83.70%，明顯高于陳飛平等[27]利用堿性蛋白酶酶解菜籽蛋白、周曉晴等[28]利用胃蛋白酶酶解鯽魚下腳料達(dá)到了46.45%、75.79%的抑制率，說(shuō)明響應(yīng)面分析法對(duì)納豆菌發(fā)酵扇貝裙邊制備 ACE抑制肽的條件優(yōu)化是可行的。

3 結(jié)論

3.1 本文以扇貝裙邊為原料，利用實(shí)驗(yàn)室分離并保藏的納豆菌作為發(fā)酵菌株，以多肽含量和 ACE抑制率為檢測(cè)指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化 ACE抑制肽制備工藝，考察發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、液料比和接種量對(duì)發(fā)酵液多肽含量和ACE抑制率的影響，以得到制備ACE抑制肽的最佳發(fā)酵工藝。在單因素的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)ACE抑制肽的制備工藝進(jìn)行四因素三水平設(shè)計(jì)，并采用Design-Expert8.0.6對(duì)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、液料比和接種量對(duì)肽含量均具有顯著影響，發(fā)酵時(shí)間與接種量的交互作用對(duì)多肽含量具有顯著影響；發(fā)酵時(shí)間、液料比和接種量對(duì) ACE抑制率具有顯著影響，接種量與發(fā)酵時(shí)間、接種量與液料比之間的交互作用對(duì) ACE抑制率具有顯著影響。響應(yīng)面法優(yōu)化制備 ACE抑制肽的最佳工藝條件為發(fā)酵時(shí)間38.4 h，發(fā)酵溫度39.9 ℃，接種量6.0%，液料比22.5。在此最佳發(fā)酵條件下，多肽含量和 ACE抑制率的理論值是203.70 mg/g和82.22%。3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為多肽含量238.91 mg/g，ACE抑制率為83.70%，IC50為5.70 mg/ml，與理論值較接近，模型可靠。該發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單可靠，多肽含量高且ACE抑制率較高，為扇貝裙邊源 ACE抑制肽的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

3.2 雖然本文已驗(yàn)證在最優(yōu)發(fā)酵條件下利用納豆菌發(fā)酵扇貝裙邊的產(chǎn)物具有較高的 ACE抑制率，但發(fā)酵得到的扇貝裙邊多肽仍是混合物，ACE抑制肽的具體序列及作用機(jī)理尚有待進(jìn)一步探究。