高速剪切-超聲聯(lián)合提取雞樹條莢蒾果降血糖成分的工藝研究

符群，王夢麗，李卉，吳桐

（東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）

雞樹條莢蒾（Viburnum sargentii Koehne）為忍冬科（Caprifoliaceae）莢蒾屬（Viburnum Linn.）落葉灌木，天然資源頗為豐富，主要分布于我國東北、西北、華北地區(qū)，朝鮮、日本、歐洲等地也有分布[1]，可入藥治療跌打損傷，腰酸腿疼。果實含綠原酸、兒茶素等多酚化合物、黃酮化合物、多糖類等活性成分，且含量均高于葉和莖；含16種氨基酸，其中6種為人體必需氨基酸，占總量的24.81%；多種微量元素：Fe、Cu、Zn、Mn等[1]；豐富的維生素B1、維生素B2、維生素C；此外還含有揮發(fā)油、熊果酸等萜類、生物堿類和甾體類成分[2～4]。對于其功效的研究，國內(nèi)主要有抗氧化、抗炎、抑菌、止咳等，國外還有抗腫瘤、降血糖等方面的研究報道[5～7]。Kunihisa Iwai[6]等研究發(fā)現(xiàn)，用莢蒾果實的凍干粉喂食小鼠，其血漿中葡萄糖含量顯著降低；且證實莢蒾果中含有抑制酶活性的成分為花青素3-桑布糖苷以及5-咖啡?？鼘幩?。

天然活性物質(zhì)的高效提取是對原料精深加工、獲得高附加值產(chǎn)品、實現(xiàn)最大利用價值的關(guān)鍵技術(shù)。對于活性物質(zhì)的提取目前多采用單一方式如：加熱回流法、索氏提取法、超聲提取法等，提取效率偏低，費時且能耗大。本研究采用高速剪切-超聲聯(lián)合法輔助乙醇提取，高速剪切分散乳化機由定子和配有多刀頭的轉(zhuǎn)子組成，轉(zhuǎn)速在10000～24000 r/min。機器運行時在底部形成負壓，產(chǎn)生強烈的機械剪切效應(yīng)及氣蝕作用，使物料分子的運動速率驟增，在定子、轉(zhuǎn)子和容器內(nèi)壁之間高速往復運動[8,9]；而超聲波具有特有的空化作用[13]、機械效應(yīng)及熱效應(yīng)，可增大介質(zhì)的分子穿透力[10,11]。兩種提取方法協(xié)同增強對原料細胞壁破壞，使提取物有效溶出，提高得率，縮短時間和能耗。

糖尿病是一類引起各項器官損傷和功能障礙的慢性疾病，已成為世界第三大嚴重威脅人類健康的非傳染病[12]。目前針對降血糖功效的研究主要采用體外酶抑制、細胞實驗和動物實驗等。

體外試驗法主要利用 α-葡萄糖苷酶抑制劑和 α-淀粉酶抑制劑可有效抑制酶活，阻礙食物中碳水化合物以及糖類分解代謝，參照抑制率表征出抑制劑在體內(nèi)的降血糖水平[13]。選擇天然食源性原料為研究對象，不僅實現(xiàn)原材料的高值化加工，提高天然產(chǎn)物的綜合利用率，而且對高血糖的干預途徑進行創(chuàng)新性探索，具有重要的研究意義。

目前國內(nèi)關(guān)于雞樹條莢蒾的研究還是以園藝、觀賞類為主，對于其活性成分及功能性的研究相對較少。本文采用高剪切-超聲聯(lián)合法輔助乙醇提取雞樹條莢蒾果中的活性物質(zhì)并測定其對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率，旨在為雞樹條莢蒾的進一步加工與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

雞樹條莢蒾鮮果：黑龍江省蘿北林業(yè)局林場提供。

α-葡萄糖苷酶：上海源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶：上海源葉生物科技有限公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）：上海源葉生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

酶標分析儀（EPOCH12）：BioTek Instruments，Inc.；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-300DE）：昆山市超聲儀器有限公司；FA25高速剪切分散乳化機：上海弗魯克流體機械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

原料去雜，45 ℃烘干，破碎為60目粉末，冷藏保存。

1.3.2 單因素試驗

準確稱取2 g原料粉，用70%乙醇溶液進行提取。在前期預實驗基礎(chǔ)上，選取顯著影響因素：剪切轉(zhuǎn)速（12000、15000、18000、21000、24000 r/min），料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50（g/mL）），提取溫度（40、50、60、70、80 ℃），在270 W功率下超聲40 min，剪切處理120 s。研究三組因素不同水平對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率影響，每組實驗做三組平行。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用中心組合Box-Benhnken Design設(shè)計試驗、建立回歸模型，得到最佳提取條件。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定方法

參照Kim J S等的方法[14～16]，略作修改。取2.5 mg/mL莢蒾果提取物100 μL于96孔板中，再加入1.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液50 μL，在37 ℃條件下孵育使酶活化，15 min后加入10 mg/mL的底物PNPG溶液50 μL，于37 ℃水浴10 min后，加入1 mol/L的Na2CO3溶液10 μL終止反應(yīng)，高速震蕩混合均勻，用酶標儀在波長405 nm處測定吸光度A1為樣品組；測定只有莢蒾果提取物反應(yīng)體系的吸光度A2為對照組，再取100 μL的磷酸鹽緩沖溶液代替莢蒾果提取物，測定其吸光度A0為空白組。每組實驗做5組平行，按照公式（1）計算抑制率。

1.3.5 α-淀粉酶抑制率的測定方法

參照Johnson M H等的方法，略作修改[17～19]。取2.5 mg/mL莢蒾果提取物100 μL于96孔板中，再加入1.5 U/mL的α-淀粉酶溶液50 μL，在37 ℃條件下孵育使酶活化，15 min后加入1.0%的可溶性淀粉溶液50 μL，于37 ℃水浴10 min后，加入1 mol/L的DNS溶液5 μL終止反應(yīng)，高速震蕩混合均勻，用酶標儀在波長540 nm處測定吸光度A1為樣品組；測定只有莢蒾果提取物反應(yīng)體系的吸光度A2為對照組；再取100 μL的磷酸鹽緩沖溶液代替莢蒾果提取物，測定其吸光度A0為空白組。每組實驗做5組平行，按照公式（1）計算抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本文采用Excel 2016、Origin 8.6、Design-Expert 8.0.6進行繪圖及數(shù)據(jù)分析、SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)處理及Duncans’差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取物對兩種酶抑制率的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 剪切轉(zhuǎn)速對酶抑制率的影響

在料液比1:30 g/mL，超聲時間40 min，剪切時間120 s，提取溫度60 ℃，超聲功率270 W的條件下研究不同的剪切轉(zhuǎn)速對雞樹條莢蒾果提取物的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的影響。結(jié)果如圖1所示。

圖1 剪切轉(zhuǎn)速對酶抑制率的影響Fig.1 Effect of shearing speed on inhibition rate enzymes

由圖1可知：隨著剪切轉(zhuǎn)速的增加，莢蒾果提取物對兩種酶的抑制率持續(xù)上升，當轉(zhuǎn)速達到 18000 r/min時均達到最大值，高速剪切乳化機轉(zhuǎn)速的增加使得機械剪切效應(yīng)、氣蝕作用增強，使原料中降血糖活性物質(zhì)逐漸溶出。此時α-葡萄糖苷酶抑制率為(64.11±1.06)%，α-淀粉酶抑制率為(50.73±0.914)%。轉(zhuǎn)速進一步增強易造成物料升溫使提取物失活，體系產(chǎn)生焦糊現(xiàn)象，導致酶的抑制活性下降。選擇轉(zhuǎn)速18000 r/min為最優(yōu)值。

2.1.2 料液比對酶抑制率的影響

剪切轉(zhuǎn)速18000 r/min，超聲時間40 min，剪切時間120 s，提取溫度60 ℃，超聲功率270 W的條件下研究不同的料液比對莢蒾果提取物的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的影響，如圖2所示。由圖2可得料液比為1:20（g/mL）時莢蒾果提取物對兩種酶產(chǎn)生最大抑制率：α-葡萄糖苷酶抑制率為(67.07±0.91)%、α-淀粉酶抑制率為(54.36±1.19)%。隨著料液比減小，原料相對于提取溶劑的量降低，提取物在低濃度下穩(wěn)定性差，導致酶抑制率降低，且試劑的大量使用帶來成本的提高。因此選取料液比1:20為最佳條件。

圖2 料液比酶對抑制率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on enzyme inhibition rate

2.1.3 提取溫度對酶抑制率的影響

在料液比1:30（g/mL），剪切轉(zhuǎn)速18000 r/min，超聲時間40 min，剪切時間120 s，超聲功率270 W的條件下研究不同的溫度對雞樹條莢蒾果提取物的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率影響，如圖3所示。

圖3 提取溫度對酶抑制率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on enzyme inhibition rate

由圖3可得，隨溫度的提高莢蒾果提取物對兩種酶的抑制率逐步增大，在60 ℃時達到最大值，α-葡萄糖苷酶抑制率為(65.25±0.96)%，α-淀粉酶抑制率為(49.23±1.18)%。較α-淀粉酶抑制率而言莢蒾果提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響受溫度變化幅度較大。在超過 70 ℃時兩種酶的抑制率均顯著下降，可見過高的溫度不僅影響提取物活性，同時導致競爭性雜質(zhì)溶出，降低莢蒾果提取物對酶的抑制率。選取60 ℃為最佳提取溫度。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果（1）以單因素試驗為基礎(chǔ)設(shè)計響應(yīng)面試驗，結(jié)果如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果Table 1 The results of response surface optimization

利用Design-Expert軟件進行優(yōu)化，剪切轉(zhuǎn)速（A）、料液比（B）、提取溫度（C）二次多項式回歸擬合，得到綜合抑制率對三個因素的回歸方程為：

利用 Design-Expert軟件進行方差分析結(jié)果見表2。由表2可得，模型的F值為37.73，p＜0.01，說明該模型極顯著，失擬項的p＞0.05，不顯著。R2=0.9798，校正決定系數(shù)(R2Adj)：0.9538。說明擬合度好，多項式回歸方程對于實際情況來說較吻合，試驗誤差小，方程的顯著性、可靠性高，可以反應(yīng)響應(yīng)值的變化。故可用回歸方程對試驗結(jié)果進行分析和預測。

表2 方差分析結(jié)果Table 2 Analysis of variance for quadric regression model

對回歸模型顯著性分析可得：A、AC、A2、B2、C2對綜合抑制率有極顯著的影響（p＜0.01），B、C、AB、BC影響不顯著（p＞0.05）。由F值可得，各因素對綜合抑制率的影響順序為：轉(zhuǎn)速（A）＞料液比（B）＞提取溫度（C）。

（3）響應(yīng)面圖和等高線圖分析

圖4 轉(zhuǎn)速和料液比對綜合抑制率交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface diagram and contour plots of interaction effects of speed and solid-liquid ratio on the overall inhibition rate

圖5 轉(zhuǎn)速和溫度對綜合抑制率交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface diagram and contour plots of interaction effects of speed and temperature on the overall inhibition rate

圖6 料液比和溫度對綜合抑制率交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface diagram and contour plots of interaction effects of solid-liquid ratio and temperature on comprehensive inhibition rate

分析圖4～6可得出剪切轉(zhuǎn)速（A）、料液比（B）和提取溫度（C）之間的交互作用對酶綜合抑制率的影響。由圖4可知，轉(zhuǎn)速的響應(yīng)曲面比料液比的響應(yīng)曲面陡峭，說明轉(zhuǎn)速對酶的綜合抑制率較料液比更為顯著。由圖6可知，料液比和溫度的變化曲面均相對平緩，可得料液比、溫度對酶綜合抑制率均不顯著，與方差分析相符。當?shù)雀呔€呈密集的橢圓形和馬鞍形時，說明兩因素交互作用顯著；呈現(xiàn)圓形時說明因素間交互作用不顯著[11]。由圖5可知，等高線密集且偏橢圓形，說明轉(zhuǎn)速和溫度對酶的綜合抑制率的交互作用顯著。由圖4可知，等高線呈現(xiàn)圓形，說明轉(zhuǎn)速和料液比之間的交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果相符。

2.3 最佳條件確定和回歸模型驗證試驗結(jié)果

通過響應(yīng)面分析得到高速剪切-超聲聯(lián)合法輔助乙醇提取雞樹條莢蒾果提取物對酶抑制率的最佳工藝條件為：高速剪切乳化機的轉(zhuǎn)速為18630 r/min，料液比1:19 (g/mL)，提取溫度60.4 ℃，超聲時間40 min，剪切時間120 s，超聲功率270 W。此條件下，對兩種酶的綜合抑制率(65.91±0.74)%，其中α-葡萄糖苷酶抑制率為(71.57±0.91)%，α-淀粉酶抑制率為(57.42±0.93)%。

為實際操作中更便于產(chǎn)業(yè)化控制，調(diào)整最佳工藝為：高速剪切乳化機的轉(zhuǎn)速18000 r/min，料液比1:19(g/mL)，提取溫度60 ℃，超聲時間40 min，剪切時間120 s，超聲功率270 W。在此條件下進行最優(yōu)工藝的驗證，得到α-葡萄糖苷酶抑制率為(72.11±0.86)%，α-淀粉酶抑制率為(56.57±1.05)%，計算得出綜合抑制率為(65.89±1.03)%，與理論值接近。

2.4 對比不同提取方式的降血糖活性

根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，分別使用單一超聲法：料液比1:19(g/mL)，提取溫度60 ℃，超聲時間40 min，超聲功率270 W；單一高速剪切法：高速剪切乳化機的轉(zhuǎn)速18000 r/min，料液比1:19 (g/mL)，提取溫度60 ℃，剪切時間120 s分別用70%乙醇進行提取，并測定2.5 mg/mL提取物的酶抑制率。結(jié)果如表3所示。

表3 3種提取方式對酶抑制率的影響Table 3 Effect of three extraction methods on enzyme inhibition rate

由表3可知，高速剪切-超聲聯(lián)合法提取的莢蒾果提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率、α-淀粉酶抑制率、以及綜合抑制率都有極顯著的提升（p＜0.01）。不同提取方法提取的雞樹條莢蒾果提取物對綜合抑制率的大小為：高速剪切-超聲聯(lián)合法＞單一超聲法＞單一高速剪切法。高速剪切-超聲聯(lián)合法比單一超聲法提高11.39%，比單一高速剪切法提高13.64%。

2.5 莢蒾果提取物IC50的測定及主要活性成分分析

2.5.1 莢蒾果提取物IC50的測定

圖7 不同濃度的提取物對酶抑制率的影響Fig.7 Effect of different concentrations of extract on inhibition rate enzymes

采用優(yōu)化的工藝條件進行提取，對莢蒾果提取物梯度稀釋，測定不同濃度提取物的酶抑制率。結(jié)果如圖7所示。

用IBM SPSS回歸分析，得出莢蒾果提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50為0.844 mg/mL，對α-淀粉酶抑制作用的IC50為1.422 mg/mL。張曉英等[20]對綠蘿花用70%乙醇浸泡過夜，超聲波處理2 h得提取物的蔗糖酶、麥芽糖酶、α-淀粉酶抑制率的IC50分別為0.82 mg/mL、0.84 mg/mL、1.23 mg/mL。趙玉紅[21]等對老山芹在料液比1:60、提取溫度80 ℃、提取時間3 h條件下熱水回流提取，得到提取物的α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50為1.37 mg/mL，α-淀粉酶抑制作用的IC50為2.45 mg/mL。與相似研究對比可知，作為一種植物資源活性物質(zhì)，莢蒾果醇提物具有一定的降血糖活性，且高速剪切-超聲聯(lián)合提取是一種能有效地節(jié)約時間和成本的工藝方法。

2.5.2 莢蒾果提取物主要活性成分分析

采用最優(yōu)的組合工藝提取莢蒾果中的活性物質(zhì)，并參考文獻[22～24]測定果實粉中可能存在的主要活性成分如：黃酮、多酚、多糖、花色苷、綠原酸的含量，進行分析。測定結(jié)果如表4所示。由表4可知，用高剪切-超聲聯(lián)合輔助醇法提取的雞樹條莢蒾果實中以總多酚、總黃酮化合物的含量為主，多糖的含量次之。初步判定莢蒾果實中酚類物質(zhì)可能是降血糖的主要活性成分，而提取物成分與酶抑制的相關(guān)性研究，將在之后試驗中展開。

表4 提取物主要活性成分分析Table 4 Analysis of main active components of extracts

3 結(jié)論

3.1 通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實驗，綜合回歸模型分析和驗證試驗得出60目的莢蒾果粉以高剪切-超聲法輔助乙醇提取的最優(yōu)工藝為：高速剪切乳化機的轉(zhuǎn)速18000 r/min，料液比1:19 (g/mL)，提取溫度60 ℃，超聲時間40 min，剪切時間120 s，超聲功率270 W。在此條件下進行最優(yōu)工藝的驗證，得到α-葡萄糖苷酶抑制率為(72.11±0.86)%，α-淀粉酶抑制率為(56.57±1.05）%，綜合抑制率為（65.89±1.03）%。并測得α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50為0.844 mg/mL，α-淀粉酶抑制作用的IC50為1.422 mg/mL。

3.2 超聲法和高速剪切法均可進行活性物質(zhì)的高效提取[25,26]。超聲法具有很強的分散力，可利用空化作用產(chǎn)生局部的高溫高壓以及巨大的沖擊力和微射流來打開團聚的顆粒、破碎細胞壁[27]。高速剪切法是通過機器產(chǎn)生強大的剪切力，使得物料發(fā)生分裂、破碎并均勻分散于介質(zhì)中[28]。超聲波具有較強的破碎細胞外壁作用，而對于內(nèi)部活性物質(zhì)充分溶出不徹底[29]；高速剪切法易使成分溶出，但破碎物料耗時較長，長時間的剪切作用易造成成分氧化、糊化，活性降低[30]?；趦煞N方法各有利弊，本研究采用超聲-高剪切聯(lián)合法提取活性物質(zhì)并測定提取物對兩種酶的抑制率。通過兩種單一提取方法分別與高速剪切-超聲聯(lián)合法的結(jié)果對比，得出高速剪切-超聲聯(lián)合法對葡萄糖苷酶抑制率、淀粉酶抑制率均有顯著的提升，且顯著地縮短了提取時間和能耗。本試驗為活性物質(zhì)的提取提供了一條新思路，為莢蒾果中有效成分的分離純化、功能性質(zhì)的研究奠定良好的基礎(chǔ)。

3.3 綜上所述，高速剪切乳化機的機械剪切效應(yīng)以及氣蝕作用和超聲波的空化作用相互協(xié)同，能較好的提高提取效率，節(jié)約時間、降低生產(chǎn)成本，采用高速剪切-超聲聯(lián)合法輔助乙醇提取莢蒾果提取物能良好保留其降血糖活性，且顯著優(yōu)于單一的提取方法。在莢蒾類果的活性成分提取工藝中，通過組合設(shè)計超聲及高速剪切型非標設(shè)備，可高效獲得優(yōu)良活性的提取物，對莢蒾屬植物產(chǎn)業(yè)鏈延長、高值化產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用具有指導意義。