脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在肝損傷修復(fù)中的作用

白薛玲　范妤　郭東艷

中國是肝病大國，乙肝病毒攜帶者近1億，患病人數(shù)超過2千萬，每年新增肝硬化患者約30萬。肝病進(jìn)展到終末期，原位肝移植（OLT）是目前首選治療方法，但肝移植存在肝源缺乏、費(fèi)用昂貴、倫理學(xué)限制、患者須長(zhǎng)期服用免疫抑制劑等問題[1]。隨著再生醫(yī)學(xué)和生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，干細(xì)胞移植成為治療肝病的新選擇。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical cord mesenchymal Stem Cells，UCMSCs）來源困難且移植過程倫理問題不可忽視。2001年Zuk等[2]發(fā)現(xiàn)，人體脂肪中也含有大量的干細(xì)胞。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）與BMSCs相似，具有低免疫源性及多向分化潛能，且來源豐富易于獲取，無免疫排斥性和倫理學(xué)限制。本文主要綜述ADMSCs在肝病治療領(lǐng)域的研究現(xiàn)況，總結(jié)其發(fā)揮肝損傷修復(fù)作用的相關(guān)機(jī)制。

1　ADMSCs的生物學(xué)特征及多向分化潛能

ADMSCs 起源于中胚層，來源豐富，約300 mL的脂肪組織通過常規(guī)分離可得到約 1×107數(shù)量的ADMSCs[3]。ADMSCs定位于血管周圍，故有學(xué)者提出ADMSC是位于周圍血管壁分化各個(gè)階段中的細(xì)胞亞群[4]。也有人推測(cè)它存在于所有器官和組織的血管周圍[5]。研究表明，骨髓、臍帶和脂肪組織來源的MSCs形態(tài)及免疫表型無明顯差異[6]。ADMSCs形態(tài)呈圓形、梭形或紡錘形，貼壁生長(zhǎng)，經(jīng)3～4代傳代后圓形細(xì)胞逐漸減少，外觀以梭形或紡錘形為主。ADSCs和BMSCs有許多相同的表達(dá)基因，如負(fù)責(zé)血管生成，基質(zhì)重塑，有絲分裂和信號(hào)通路分化的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）等[7]。

MSCs表面抗原不具有特異性，其表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志，因此國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)提出了鑒定MSC的3個(gè)最低標(biāo)準(zhǔn)[8]：1）貼壁生長(zhǎng)；2）表達(dá)CD73、CD90和CD105，不表達(dá)CD11b、CD14、CD19、CD45、CD79α或HLA-DR；3）具有分化為脂肪細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的潛能。ADMSCs與BMSCs共同的標(biāo)記包括 CD13、CD29、CD44、CD90、CD105 和 CD166[9]。CD49（+） CD106（-）是 ADMSCs 區(qū)別于 BMMSCs 的標(biāo)志。另外，AMSCs 低表達(dá)HLA-Ⅰ類抗原，不表達(dá)HLA-Ⅱ類抗原[9]。ADMSCs 標(biāo)記的表達(dá)可能取決于培養(yǎng)條件及培養(yǎng)時(shí)間，隨傳代次數(shù)增多，ADMSCs 可表達(dá)CD11b、CD14、CD45和CD34等造血干細(xì)胞標(biāo)記[10]。流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化等檢測(cè)對(duì)確認(rèn)ADMSCs有輔助作用，但目前最好的鑒定方法是多系定向誘導(dǎo)并進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)[11]。

ADMSCs 具有跨胚層分化能力和多向分化潛能，能夠分化為中胚層來源的脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞[12]，還可以分化為來源于外胚層的神經(jīng)細(xì)胞[13]、內(nèi)胚層的肝細(xì)胞[14]等多種細(xì)胞類型。大量證據(jù)表明，ADMSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化能夠模仿幾乎所有體細(xì)胞的生物和形態(tài)學(xué)特征[15]。

2　ADMSCs 對(duì)肝損傷的治療作用

大量研究證實(shí)，ADMSCs 移植具有改善肝功能、減輕肝纖維化、修復(fù)肝臟損傷作用。其治療機(jī)制可能通過以下幾個(gè)方面實(shí)現(xiàn)。

2.1　分化為肝細(xì)胞

ADMSCs 經(jīng)體外誘導(dǎo)，能夠分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞（hepatocytelike cells, HLCs），且能表達(dá)肝細(xì)胞特異性標(biāo)記物。Seo 等[14]首次報(bào)道了ADMSCs 能在體外分化為HLCs，并表達(dá)白蛋白（Alb）等肝細(xì)胞特異性標(biāo)記物。Agnieszka等[16]分離了6名接受胃癌切除術(shù)患者的ADMSCs，發(fā)現(xiàn)經(jīng)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF1、FGF4）孵育后，ADMSCs表現(xiàn)出高度肝分化能力，表達(dá)人類肝細(xì)胞的肝臟標(biāo)記。Yamamoto等[17]通過聚類分析發(fā)現(xiàn)由 ADMSCs分化而來的肝細(xì)胞和正常肝細(xì)胞在基因表達(dá)方面極為相似。表明 ADMSCs 經(jīng)誘導(dǎo)可在體外分化為肝細(xì)胞，表達(dá)肝細(xì)胞特征。

Krap等[18]定義了MSCs的“歸巢”特性，即能夠趨向性遷移至某些特定的，特別是損傷及缺血的組織中。許多學(xué)者利用這一特性研究在肝損傷微環(huán)境中直接移植ADMSCs入肝內(nèi)，自行分化為肝細(xì)胞，修復(fù)損傷的作用。Horng等[19]發(fā)現(xiàn)，硫代乙酰胺（TAA）誘導(dǎo)的肝損傷條件下，ADMSCs 通過直接經(jīng)肝注射能夠在大鼠肝內(nèi)自行分化為人肝細(xì)胞樣細(xì)胞，經(jīng)移植后大鼠ALT、AST、Alb、總膽紅素（TBIL）水平，肝組織病理形態(tài)逐漸趨于正常。而Guangfeng等[20]發(fā)現(xiàn)，ADMSCs 經(jīng)肝移植入D-氨基半乳糖建立的肝衰竭模型3 d 后，沒有分化為肝細(xì)胞。這些研究表明，肝損傷的微環(huán)境有利于移植的 ADMSCs 向肝組織遷移和定植。而未經(jīng)誘導(dǎo)的 ADMSCs 能否在肝內(nèi)自行分化，肝臟損傷的微環(huán)境對(duì)分化促進(jìn)作用還需要進(jìn)一步證實(shí)。

2.2　免疫調(diào)節(jié)作用

同BMSCs相似，ADMSCs 能夠廣泛參與免疫調(diào)節(jié)，主要包括抑制淋巴細(xì)胞的活化和分裂增殖[21]。Wan 等[22]發(fā)現(xiàn)，ADMSCs 移植可顯著抑制 T 淋巴細(xì)胞增殖，并且可顯著減輕移植大鼠的急性排斥反應(yīng)。Higashimoto等[23]發(fā)現(xiàn)ADMSCs 能夠通過抑制 T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞抑制肝炎。Mohammadzadeh等[24]報(bào)道了ADMSCs 具有調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞（Th）細(xì)胞亞群分化的能力，能夠在抑制T細(xì)胞的同時(shí)抑制Th1，Th2和Th17細(xì)胞。表明了ADMSCs 可以抑制以T淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞，從而避免由過度免疫反應(yīng)引起的肝損傷。此外，由于ADMSCs不表達(dá)HLA-DR，抗原性低，能夠誘導(dǎo)免疫耐受并抑制移植后的免疫排斥。

2.3　分泌營(yíng)養(yǎng)因子

ADMSCs可分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（MCSF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）等，通過自分泌或旁分泌的形式作用于周圍細(xì)胞[25]。Reza等[26]用人ADMSCs 移植入CCl4誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠，觀察到經(jīng)ADMSCs 處理的動(dòng)物血清中ALT水平改善， IL-6分泌明顯增多。Banas等[27]研究發(fā)現(xiàn)，ADMSCs能夠通過分泌HGF減輕肝臟炎癥，治療肝纖維化。Yu Saito等[28]發(fā)現(xiàn)，ADSCs與肝細(xì)胞共培養(yǎng)通過分泌VEGF刺激缺血再灌注小鼠肝再生，改善肝損傷。IL-6 由肝臟巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠在肝再生過程中起到優(yōu)化作用。肝細(xì)胞再生受促血管和抗血管生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)，VEGF是所有調(diào)節(jié)因子中最重要的一種，能夠促進(jìn)肝細(xì)胞再生，改善肝功能。HGF是肝臟損傷后肝細(xì)胞再生的激發(fā)因子，能夠促進(jìn)成熟肝細(xì)胞分裂，顯著提高肝再生能力。研究結(jié)果表明，ADMSCs移植能夠促進(jìn)肝再生能力，改善肝損傷。

2.4　抑制肝纖維化

肝纖維化是肝內(nèi)結(jié)締組織的異常增生，任何肝臟損傷在肝臟修復(fù)過程中都有肝纖維化的過程。目前普遍接受的病理機(jī)制是a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)的產(chǎn)生和增殖以及肝星狀細(xì)胞（HSC）活化的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，ADMSCs 移植入肝纖維化大鼠體內(nèi)能夠降低 a-SMA 的表達(dá)，從而降解膠原纖維[19]。Yu等[29]發(fā)現(xiàn)，與HSCs共培養(yǎng)72h后，ADMSCs 能夠抑制HSCs的增殖活化，促進(jìn)HSCs凋亡。ADMSCs移植后經(jīng)CT掃描門靜脈，發(fā)現(xiàn)肝臟灌注增加，且VEGF表達(dá)減少，這將改善纖維化肝臟的微循環(huán)，減少進(jìn)一步的損害[30]。因此，ADMSCs 移植不僅能改善肝功能生化水平，還能夠減輕肝纖維化程度。

3　ADMSCs 在肝病治療中的初步臨床研究

ADMSCs 在肝病領(lǐng)域多集中于基礎(chǔ)研究，初步臨床研究表明ADMSCs 移植治療晚期肝病初顯成效。Yoshio等[31]從4例肝硬化患者腹部及臀部抽吸脂肪進(jìn)行 ADMSCs 的分離純化，經(jīng)肝動(dòng)脈輸注移植入肝臟。其中3例患者在移植后的3～6個(gè)月內(nèi)ALB水平顯著提升，且未觀察到嚴(yán)重不良反應(yīng)。柳林等[32]報(bào)道了自體 ADMSCs 經(jīng)肝動(dòng)脈移植治療肝硬化患者的臨床研究。結(jié)果表明，經(jīng)移植2、4、8周后，8名患者肝功能各項(xiàng)指標(biāo)（ALT、TBIL、ALB 、PTA）均明顯改善，癥狀明顯好轉(zhuǎn)，未見術(shù)后不良反應(yīng)。肖克勤[33]選取晚期肝病患者11例，經(jīng)肝動(dòng)脈移植自體ADSCs 治療2 周及 8 周后，各項(xiàng)指標(biāo)（ALT、TBIL、ALB、PTA）均有明顯好轉(zhuǎn)，且未觀察到不良反應(yīng)。這初步表明ADMSCs 移植對(duì)于晚期肝病療效確切，初步提示了自體 ADMSCs 經(jīng)肝動(dòng)脈移植的可行性及安全性。

4　問題與展望

ADMSCs 具有巨大的研究潛力和應(yīng)用前景，逐漸成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，基礎(chǔ)和臨床研究表明，ADMSCs在特定條件下既能分化為肝細(xì)胞，補(bǔ)充肝細(xì)胞數(shù)量，又能利用“歸巢”特性定值于受損肝組織，分泌多種營(yíng)養(yǎng)因子，抑制肝纖維化，促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)和再生。

然而，ADMSCs 研究時(shí)間較短，研究深度不及其他MSCs，目前仍存在許多問題亟待解決：1)ADMSCs 沒有特異的免疫標(biāo)記物，其分離、培養(yǎng)方法未標(biāo)準(zhǔn)化，因此建立統(tǒng)一的識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)及分離、培養(yǎng)方法是ADMSCs 臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。2)ADMSCs 向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化效果還需進(jìn)一步證實(shí)，其在肝內(nèi)定值的機(jī)制也需要進(jìn)一步明確。3)MSCs 潛在的致瘤風(fēng)險(xiǎn)不可忽視。MSCs分泌的營(yíng)養(yǎng)因子有利于惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[34]，其分泌的免疫抑制因子可能降低免疫系統(tǒng)識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力[35]。有研究提示，ADMSCs 在人體內(nèi)可通過趨化因子作用突變?yōu)槟[瘤細(xì)胞[36]。由于ADMSCs 的自發(fā)轉(zhuǎn)化問題尚存爭(zhēng)議，臨床應(yīng)用前還需要大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和全面的安全性評(píng)估。4)ADMSCs 治療的時(shí)效性，注入細(xì)胞的數(shù)量、途徑尚未統(tǒng)一。有研究提出，ADMSCs 經(jīng)自體靜脈注射有可能被困在肺微循環(huán)中[37]，且目前臨床研究多為小樣本，其可行性尚需大樣本的隨機(jī)對(duì)照研究驗(yàn)證。

相信隨著生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，ADMSCs 的研究逐步深入，將在不久的將來造福人類。

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