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    脊髓灰質(zhì)炎IgG抗體檢測(cè)試劑參考品的制備及標(biāo)定

    2018-12-21 12:41:40譚振國(guó)楊蓉羅芳宇
    關(guān)鍵詞:標(biāo)定質(zhì)量控制

    譚振國(guó) 楊蓉 羅芳宇

    [摘要] 目的 建立脊髓灰質(zhì)炎IgG抗體檢測(cè)試劑參考品,為脊髓灰質(zhì)炎IgG抗體檢測(cè)試劑盒的性能評(píng)價(jià)提供可靠的質(zhì)控品。 方法 通過(guò)中和實(shí)驗(yàn)對(duì)血清進(jìn)行確認(rèn),獲得了符合要求的血清,每個(gè)型別參考品有22份樣品,包含10份陽(yáng)性參考品、10份陰性參考品、1份最低檢出量參考品、1份精密性參考品。 結(jié)果 脊灰病毒IgG抗體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型陰性參考品符合率均不低于9/10,陽(yáng)性參考品符合率均不低于8/10,精密性參考品變異系數(shù)均不高于15%,最低檢出量參考品均不低于1∶8;參考品37℃放置5 d,反復(fù)凍融5次后穩(wěn)定性良好。 結(jié)論 制備的脊髓灰質(zhì)炎IgG抗體檢測(cè)試劑參考品經(jīng)各項(xiàng)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果合格,可用于脊髓灰質(zhì)炎IgG抗體檢測(cè)試劑的質(zhì)控。

    [關(guān)鍵詞] 脊髓灰質(zhì)炎IgG抗體;參考品;質(zhì)量控制;標(biāo)定

    [中圖分類號(hào)] R373.22 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2018)09(a)-0021-04

    [Abstract] Objective Referance products were developed for assay kit of IgG of poliomyelitis to make it possible to reliably control quality of the assay kits in evaluating their properties. Methods Serum was confirmed through a neutralization test to obtain the serum which met requirements. Twenty-two samples were collected for each type of reference products, including 10 positive reference products, 10 negative ones, 1 reference product with the minimum detection limit and 1 precise reference product. Results The conformity ratio of type Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ negative reference products of IgG of poliomyelitis was not below 9/10. The conformity ratio of positive reference products was not lower than 8/10, the coefficient of variation of precise reference was not higher than 15%, and the coefficient of variation of precise reference products was not lower than 1/8. The reference products were placed at 37℃ for 5 days. They were still quite stable after 5 repetitive freezing and thawing. Conclusion The prepared reference products of assay kit for IgG of poliomyelitis were tested to be qualified in all tests and could be used for quality control over such assay kits.

    [Key words] Polio IgG antibody; Reference; Quality control; Characterization

    脊髓灰質(zhì)炎是由脊髓灰質(zhì)炎病毒所造成的傳染性極強(qiáng)的疾病,無(wú)特效治療方法,但可通過(guò)疫苗預(yù)防。盡管20世紀(jì)50年代以來(lái)就有有效的脊灰疫苗,在20世紀(jì)80年代前,每年仍有>35萬(wàn)兒童因脊髓灰質(zhì)炎而麻痹。因此世界衛(wèi)生組織(WHO)1988年發(fā)起全球消滅脊髓灰質(zhì)炎的倡議。到1999年,脊髓灰質(zhì)炎病例已減少了99%,但全球仍未能實(shí)現(xiàn)消滅脊髓灰質(zhì)炎的目標(biāo)[1]。目前脊髓灰質(zhì)炎病毒在巴基斯坦、阿富汗、尼日利亞和印度仍有傳播[2-3],使我國(guó)脊髓灰質(zhì)炎野病毒(wild polio virus,WPV)輸入性風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)存在,2011年,我國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)發(fā)生了由巴基斯坦輸入的WPV引起的暴發(fā)疫情[4-7]。全球消滅脊髓灰質(zhì)炎形勢(shì)不容樂(lè)觀,尤其是與我國(guó)相鄰國(guó)家脊髓灰質(zhì)炎疫情呈高發(fā)態(tài)勢(shì),我國(guó)發(fā)生WPV輸入的風(fēng)險(xiǎn)增大[8-9]。隨著WHO消滅脊髓灰質(zhì)炎進(jìn)程的實(shí)施,全球首劑Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(IPV)在昆明生物所研制成功,IPV的生產(chǎn)已成為防控脊髓灰質(zhì)炎感染流行、保持人群高免疫水平并最終消滅脊髓灰質(zhì)炎的關(guān)鍵[10]。無(wú)論疫苗的效力實(shí)驗(yàn),還是疫苗免疫效果評(píng)價(jià)都會(huì)進(jìn)行抗體的檢測(cè),而脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體參考品的建立目前沒(méi)有報(bào)道,因此,有必要建立脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG抗體參考品對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG抗體檢測(cè)試劑的質(zhì)量進(jìn)行規(guī)范。在此前提下,本實(shí)驗(yàn)室制備及標(biāo)定了三套分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體檢測(cè)試劑的參考品,用于不同型別脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG抗體檢測(cè)試劑的質(zhì)控,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下:

    1 材料與方法

    1.1 參考品的組成

    Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型參考品均包含10份陽(yáng)參、10份陰參、1份最低檢出量參考品、1份精密性參考品。

    1.2 試劑

    本實(shí)驗(yàn)室制備的脊髓灰質(zhì)炎IgG抗體檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20170901)。

    1.3 儀器

    離心機(jī),水浴鍋,隔水式恒溫培養(yǎng)箱,二氧化碳培養(yǎng)箱,酶標(biāo)儀。

    1.4 中和抗體實(shí)驗(yàn)

    待測(cè)樣品(1∶4稀釋)經(jīng)56℃滅活30 min后,加至96孔板中,50 μL/孔,作2倍系列稀釋后,分別與100 CCID50的IPV病毒懸液于37℃中和2 h;加入(2~3)×105個(gè)/mL的Hep-2細(xì)胞懸液,100 μL/孔,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。將能抑制50%細(xì)胞病變的最高稀釋度定為IPV抗體的中和效價(jià),并以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示。每次試驗(yàn)均設(shè)病毒回滴試驗(yàn),回滴結(jié)果在32~320 CCID50/孔時(shí),試驗(yàn)判為成立。以中和效價(jià)≥8判為中和抗體陽(yáng)性。

    1.5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)競(jìng)爭(zhēng)法

    標(biāo)化參考品使用本實(shí)驗(yàn)室制備的脊髓灰質(zhì)炎IgG抗體檢測(cè)試劑盒(ELISA法)檢測(cè),最低檢出量參考品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型均以1∶2、1∶4、1∶8及1∶16,在板上作2倍系列稀釋;每型別陰參10份,每份1孔;陽(yáng)參10孔,每份1孔;每型別精密性參考品1份,連加10孔。待測(cè)樣品20 μL/孔,設(shè)陰性3孔、陽(yáng)性2孔、空白1孔,各型待標(biāo)參考品分別加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗原檢測(cè)板中,再分別加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型IPV-HRP,90 μL/孔,37℃保溫2 h;0.01 mol/L PBST洗板5次,TMB 37℃顯色10 min終止反應(yīng)。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量樣品吸光度值(A值)。

    1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    1.6.1 熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 將3套參考品37℃放置3、5 d后(37℃放置1 d,取出檢測(cè))。

    1.6.2 凍融試驗(yàn) 將3套參考品反復(fù)凍融3、5次后,取出檢測(cè)。

    2 結(jié)果

    2.1 中和實(shí)驗(yàn)制備參考品

    2.1.1 陽(yáng)性參考品 經(jīng)中和試驗(yàn)確認(rèn)脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體陽(yáng)性,人血清(HS)以每名患者的雙份血清均可中和脊髓灰質(zhì)炎病毒,HS抗體效價(jià)為1∶8~1∶256,選取高中低不同效價(jià)的HS制備成4份陽(yáng)性參考品,因無(wú)法篩到單型別抗體陽(yáng)性樣品,故HS均為三價(jià)中和抗體陽(yáng)性,抗體編號(hào)為HS1~HS4,3個(gè)型別陽(yáng)參1~陽(yáng)參4為相同效價(jià)血清;檢測(cè)不同型別牛血清(CS)和兔血清(RS)的效價(jià),稀釋成高中低不同效價(jià)的6份陽(yáng)性參考品,各型陽(yáng)參編號(hào)見(jiàn)表1。各型別10份陽(yáng)參2次中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)均為陽(yáng)性。

    2.1.2 陰性參考品 經(jīng)中和實(shí)驗(yàn)確認(rèn)脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體陰性,HS以每名患者的雙份血清均不能完全中和脊髓灰質(zhì)炎病毒,抗體效價(jià)<1∶8,制備成6份陰性參考品,編號(hào)為HS5~HS10,各型前6份陰參均相同;選取其他型別的CS和RS作為4份陰性參考品,各型陰參編號(hào)見(jiàn)表2。各型別10份陰參2次中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)均為陰性。

    2.1.3 最低檢出量參考品 各型中選取1份2次中和抗體為陽(yáng)性的血清,經(jīng)1∶2、1∶4、1∶8及1∶16倍比稀釋作為最低檢出限參考品。

    2.1.4 精密性參考品 各型中選取1份2次中和抗體為陽(yáng)性的血清稀釋后作為精密性參考品。

    2.2 ELISA法標(biāo)定參考品

    2.2.1 陽(yáng)性參考品標(biāo)定結(jié)果 使用3批次脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體檢測(cè)試劑、9人次對(duì)10份陽(yáng)性參考品進(jìn)行檢測(cè),Ⅰ型陽(yáng)性參考品符合率為94.4%,Ⅱ型陽(yáng)性參考品符合率為90.0%,Ⅲ型陽(yáng)性參考品符合率為97.8%。見(jiàn)表3。

    2.2.2 陰性參考品標(biāo)定結(jié)果 3批9人次對(duì)陰性參考品進(jìn)行檢測(cè),10份陰性參考品符合率為100%。見(jiàn)表4。

    2.2.3 最低檢出量參考品標(biāo)定結(jié)果 3批9人次對(duì)最低檢出量參考品進(jìn)行檢測(cè),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型最低檢出量參考品9次檢測(cè)值均在1∶8~1∶32。見(jiàn)表5。

    2.2.4 精密性參考品標(biāo)定結(jié)果 檢測(cè)試劑的精密度用變異系數(shù)(CV)來(lái)衡量。在板上連加10孔精密性參考品,其CV=標(biāo)準(zhǔn)差(SD)/平均值(x)×100%。9人次檢測(cè)結(jié)果顯示(表6),Ⅰ型精密度參考品CV值在2.56%~8.14%之間,平均5.64%;Ⅱ型精密度參考品CV值在2.71%~9.24%之間,平均5.21%;Ⅲ型精密度參考品CV值在3.48%~11.24%之間,平均6.37%。各批次CV值均<15%,符合檢測(cè)試劑對(duì)精密度的要求。

    2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型待標(biāo)參考品在37℃加速破壞試驗(yàn)或凍融試驗(yàn)后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7~9。各型參考品:10份陽(yáng)參均>9/10,10份陰參均為陰性,精密性參考品的CV值均<15%,各型最低檢出參考品均不低于1∶8。

    3 討論

    生物制品中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一種由不同時(shí)間、不用地點(diǎn)、不同條件、不同操作者得出相對(duì)一致性結(jié)果的工具。因此,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為生物制品生產(chǎn)檢定中必不可少的重要組成部分,在生物制品質(zhì)量控制和效力評(píng)價(jià)中發(fā)揮重要作用[11]。

    診斷試劑參考品一般從靈敏性、特異性、精確性、穩(wěn)定性四個(gè)方面進(jìn)行考察[12]。使用陰陽(yáng)性參考品對(duì)診斷試劑的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià),本實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性參考品由脊髓灰質(zhì)炎中和抗體陽(yáng)性的血清組成,由于HS無(wú)法篩到僅單個(gè)型別抗體陽(yáng)性的血清,因而3個(gè)型別的陽(yáng)參1~4均為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗體均為陽(yáng)性且效價(jià)不同的人血清HS1~HS4,其他6份陽(yáng)參為本型別高中低不同效價(jià)的CS和RS組成。其目的在于高濃度的陽(yáng)參用于防止抗體濃度過(guò)高引起前帶效應(yīng)的存在,而使檢測(cè)出假陰性;低濃度的陽(yáng)參是用于防止弱陽(yáng)性樣品漏檢而設(shè)置。陰參由6份脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體陰性的HS1~HS6和其他型別抗體陽(yáng)性的CS、RS組成,用于防止假陽(yáng)性的檢出和是否存在型間交叉。

    標(biāo)定出的最低檢出量參考品的含量可對(duì)診斷試劑的靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià),在檢測(cè)過(guò)程中可以監(jiān)測(cè)試劑盒的檢測(cè)下限是否符合要求。

    根據(jù)國(guó)家藥典對(duì)診斷試劑的要求,用于酶聯(lián)診斷試劑的精密度(CV)應(yīng)不高于15%(n = 10)[13]。本次標(biāo)定的精密性參考品選取檢中和抗體陽(yáng)性、酶標(biāo)檢測(cè)A值在0.6~0.8之間的樣品來(lái)控制檢測(cè)試劑的孔間差。

    穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值隨時(shí)間變化的性質(zhì),即在規(guī)定的時(shí)間間隔和環(huán)境條件下,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值報(bào)紙?jiān)谝?guī)定范圍的性質(zhì)[14]。考慮到參考品在保存、使用、運(yùn)輸過(guò)程中可能出現(xiàn)的情況,本研究設(shè)計(jì)了37℃加速破壞試驗(yàn)和凍融試驗(yàn)對(duì)參考品的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,37℃放置5 d或凍融3次仍可達(dá)到質(zhì)控參考品的合格標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)分別使用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎IgG抗體檢測(cè)試劑對(duì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗體參考品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果均符合參考品的質(zhì)量要求。

    脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG抗體的水平對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒的血清流行病學(xué)調(diào)查和疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)具有重要意義[15]。檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎抗體的方法主要有經(jīng)典的中和抗體實(shí)驗(yàn)和ELISA法。微量細(xì)胞病變法是腸道病毒中和抗體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,在脊髓灰質(zhì)炎病毒和EV71中和抗體檢測(cè)中均得到普遍應(yīng)用[16-20],但此方法檢測(cè)過(guò)程較繁瑣,檢測(cè)周期長(zhǎng),檢測(cè)結(jié)果影響因素較多。用ELISA法檢測(cè)抗體則操作簡(jiǎn)便,不需要特殊儀器,3~5 h即可出結(jié)果而更具有廣泛的實(shí)用前景,但目前所報(bào)道的脊髓灰質(zhì)炎抗體ELISA檢測(cè)方法僅能檢測(cè)單一種屬的抗體,而脊髓灰質(zhì)炎病毒的血清學(xué)調(diào)查檢測(cè)的是HS,疫苗的效力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)是動(dòng)物血清,制備脊髓灰質(zhì)炎抗體也需要對(duì)動(dòng)物血清進(jìn)行檢測(cè),沒(méi)有一種既能檢測(cè)HS又能檢測(cè)動(dòng)物血清的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG抗體檢測(cè)方法。因此,制備出針相應(yīng)的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG抗體診斷試劑的參考品勢(shì)在必行,脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體檢測(cè)參考品的研制,可以為今后可檢測(cè)不同種屬的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG抗體診斷試劑的研發(fā)及質(zhì)量控制提供必要的保證。用中和抗體檢測(cè)的方法制備出3套針對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗體檢測(cè)的參考品,并且在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所(以下簡(jiǎn)稱“我所”)制備脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG抗體檢測(cè)試劑上進(jìn)行標(biāo)化,并確定了參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):陰性參考品符合率不低于9/10,陽(yáng)性參考品符合率不低于8/10,精密性參考品變異系數(shù)不高于15%,最低檢出量參考品不低于1∶8。

    綜上所述,由我所制備的脊髓灰質(zhì)炎IgG抗體的3個(gè)型別的參考品是成功的,不僅可以對(duì)我所制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG抗體診斷試劑質(zhì)量控制起到重要作用,也為其他廠家研發(fā)檢測(cè)不同種屬的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG抗體診斷試劑提供了必要的質(zhì)量參考。

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    (收稿日期:2018-02-06 本文編輯:張瑜杰)

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