通天草醇提物對阿爾茨海默病小鼠行為學(xué)及海馬炎癥介質(zhì)的影響

仲麗麗 張維嘉 劉旭

[摘要] 目的 探討通天草醇提物對阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)能力、記憶能力、學(xué)習(xí)記憶保持能力等行為學(xué)及海馬炎癥介質(zhì)白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量的影響。 方法 根據(jù)隨機數(shù)字表法將48只雄性C57BL/6小鼠分為六組：模型組、正常組、多奈哌齊組和通天草醇提物高、中、低劑量組，每組8只。采用Aβ1-42（80 pmol/μL）雙側(cè)腦室注射的方法誘導(dǎo)阿爾茨海默病模型，各組實驗開始每天灌胃1次，多奈哌齊組小鼠給予0.000 92 g/（kg·d）灌胃，通天草醇提物高、中、低劑量組小鼠分別給予3.96、1.98、0.99 g/（kg·d）灌胃，而正常組和模型組小鼠給予生理鹽水灌胃，連續(xù)治療35 d。采用Morris水迷宮檢測阿爾茨海默病小鼠行為學(xué)的改變，酶聯(lián)免疫吸附法檢測阿爾茨海默病小鼠海馬IL-1β、TNF-α含量。 結(jié)果 模型組小鼠的逃避潛伏期及游泳距離增加，同時伴有目標(biāo)停留時間縮短和跨平臺次數(shù)減少，尋找到水迷宮系統(tǒng)水下平臺所需要的時間較長，與正常組比較，模型組小鼠行為學(xué)出現(xiàn)明顯異常（P < 0.05）；與正常組比較，模型組海馬炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，通天草醇提物高、中劑量組小鼠行為學(xué)明顯改善，海馬IL-1β、TNF-α水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 通天草醇提物能夠改善小鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶障礙，降低炎性反應(yīng)并緩解血腦屏障損傷，在阿爾茨海默病治療中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞] 通天草；阿爾茨海默病；行為學(xué)；炎癥介質(zhì)

[中圖分類號] R285.5 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（a）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of alcohol extract of Waternut Herb on learning ability， memory ability， learning and memory retention ability of mice with Alzheimer disease， and the effects of interleukin （IL）-1β and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in hippocampal inflammation media. Methods Forty-eight male C57BL/6 mice were divided into six groups according to the random number table method： model group， normal group， Donepezil group， and high， medium， low dose of alcohol extract of Waternut Herb group， with 8 mice in each group. Alzheimer disease model was induced by bilateral intracere broventricular injection of Aβ1-42 （80 pmol/μL）. Each group of rats was given intragastric administration once a day. The mice in Donepezil group were given 0.000 92 g/（kg·d） by gavage. The mice in the high， medium， low dose of alcohol extract of Waternut Herb group were given 3.96， 1.98， 0.99 g/（kg·d） by gavage， respectively. While the mice in the normal group and model group were given intragastric administration with continuous saline， treatment for 35 days. The Morris water maze was used to detect the changes of behavior in Alzheimer disease mice. The levels of IL-1β and TNF-α in hippocampus of Alzheimer disease mice were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Results The incubation period and swimming distance of mice in the model group were increased. At the same time， the target residence time was shortened and the number of cross-platforms was reduced， it took a long time to find the underwater platform of the water maze system， compared with the normal group， the abnormal behavior in the model group was significantly increased （P < 0.05）. Compared with the normal group， the levels of IL-1β and TNF-α of the inflammatory mediators of the hippocampus in model group were significantly increased （P < 0.05）. Compared with the model group， the behavior of mice in the high and medium doses of alcohol extract of Waternut Herb group was significantly improved， and the levels of IL-1β and TNF-α in the hippocampus were significantly decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Alcohol extract of Waternut Herb can improve the learning ability and memory impairment of mice， reduce the inflammatory response and relieve blood-brain barrier injury， and plays an important role in the treatment of Alzheimer disease.

[Key words] Waternut Herb； Alzheimer disease； Behavioristics； Inflammatory mediators

阿爾茨海默病是一種進行性的逐漸發(fā)展的神經(jīng)變性疾病之一[1-2]，其特征為神經(jīng)元外沉積β-淀粉樣蛋白和神經(jīng)元內(nèi)Tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)[3]。β-淀粉樣蛋白積累后誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞活化和促進炎癥介質(zhì)上調(diào)[4]，還能誘發(fā)學(xué)習(xí)記憶能力減退，引起行為學(xué)異常[5-6]。阿爾茨海默病神經(jīng)血管假說證實，β-淀粉樣蛋白產(chǎn)生和清除平衡破壞導(dǎo)致腦β-淀粉樣蛋白水平增加引起血管毒性，神經(jīng)性炎性反應(yīng)是阿爾茨海默病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[7-8]，可見，阿爾茨海默病出現(xiàn)行為學(xué)異常與炎癥介質(zhì)異常是常見的。

據(jù)研究，通天草對阿爾茨海默病模型學(xué)習(xí)記憶[9]、形態(tài)學(xué)[10]、細胞凋亡[11]、NF-κB p65[12]、血腦屏障[13]、β-淀粉樣蛋白前體蛋白[14]等有改善作用，對肝纖維化、抑郁模型小鼠行為具有改善作用[15-16]。本實驗采用通天草醇提物，以Aβ1-42誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠模型為研究對象，探討通天草醇提物對阿爾茨海默病小鼠行為學(xué)和炎癥介質(zhì)的影響，期望為防治阿爾茨海默病奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級6月齡雄性C57BL/6小鼠68只，體重（22±2）g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心[許可證號SCXK（黑）2013-012]，小鼠在常溫常濕設(shè)施環(huán)境內(nèi)自由攝取食物且分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑 通天草醇提物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究院提供；鹽酸多奈哌齊（重慶植恩藥業(yè)公司，批號：20141201）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20140401）；Aβ1-42（北京博奧森公司，批號：bs-0107p）。

1.1.3 儀器 RT-雷杜酶標(biāo)儀6100型（美國RT公司）；腦立體定位儀STW-1型（成都儀器制造廠）；臺式全自動離心機TGL-16G型（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Morris水迷宮系統(tǒng)ZH-DSG型（安徽淮北正華生物儀器公司）等。

1.2 方法

1.2.1 阿爾茨海默病模型 參考文獻[17-23]制備阿爾茨海默病小鼠模型。各組小鼠用水合氯醛麻醉，將其固定，剃掉頭頂上的毛露出顱骨，用腦立體定位儀定位海馬，微量加樣器一次性注入10 μg凝聚態(tài)Aβ1-42（80 pmol/μL）注進雙側(cè)腦室海馬區(qū)，停留10 min緩慢退，骨蠟封閉，將其包扎，青霉素消炎預(yù)防感染；正常組給予等量生理鹽水注射雙側(cè)腦室。實驗造模前初始小鼠48只，造模后死亡5只，經(jīng)過水迷宮系統(tǒng)篩查，優(yōu)選40只學(xué)習(xí)記憶能力較差（60 s內(nèi)不可尋找到Morris水迷宮系統(tǒng)第Ⅳ象限平臺）小鼠為阿爾茨海默病模型。

1.2.2 分組與給藥 按照隨機數(shù)字表法將40只阿爾茨海默病小鼠模型分為模型組、多奈哌齊組和通天草醇提物高、中、低劑量組，每組8只，同時選擇健康6月齡雄性C57BL/6小鼠8只為正常組。其中多奈哌齊組小鼠給予0.000 92 g/（kg·d）灌胃，通天草醇提物高、中、低劑量組小鼠分別給予3.96、1.98、0.99 g/（kg·d）灌胃，而正常組和模型組小鼠則給予生理鹽水灌胃，各組給藥35 d。

1.2.3 測定學(xué)習(xí)能力 灌胃結(jié)束后經(jīng)過1 d休整期，參考文獻[18，23]采用Morris水迷宮系統(tǒng)測定小鼠學(xué)習(xí)能力，水深20 cm，直徑12 cm，（23±2）℃水溫，平臺放于水迷宮系統(tǒng)第Ⅳ象限，經(jīng)過1～4 d訓(xùn)練后，各組小鼠學(xué)習(xí)能力不斷提高，每次訓(xùn)練實踐60 s，若60 s未找到平臺，將小鼠放第Ⅳ象限平臺15 s潛伏期為60 s，第5天使用水迷宮系統(tǒng)測定小鼠逃避潛伏期評價小鼠學(xué)習(xí)能力。

1.2.4 測定記憶能力 實驗結(jié)束后過程同“1.2.3”，第5天撤去第Ⅳ象限平臺，檢測在60 s內(nèi)小鼠找到水迷宮系統(tǒng)第Ⅳ象限平臺的游泳距離，評價小鼠記憶能力。

1.2.5 測定學(xué)習(xí)記憶保持能力 實驗結(jié)束后過程同“1.2.3”，在第5天撤去第Ⅳ象限平臺，檢測在60 s內(nèi)小鼠在平臺所在水迷宮系統(tǒng)第Ⅳ象限目標(biāo)停留時間（游泳時間）和跨平臺次數(shù)（跨越平臺所在位置次數(shù)），用以學(xué)習(xí)記憶保持能力的評價。

1.2.6 測定海馬炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α含量 將實驗小鼠斷頭處置放在冰袋上迅速取出海馬，然后勻漿，放入離心機5000 r/min離心10 min，r = 5 cm，按組分裝，-20℃保存樣品。用RT-雷杜酶標(biāo)儀6100型450 nm波長測定各孔組織吸光度（A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照方程測定IL-1β、TNF-α含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析各組的數(shù)據(jù)結(jié)果，兩兩之間比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 通天草醇提物對阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠逃避潛伏期延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和通天草醇提物高、中劑量組小鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 通天草醇提物對阿爾茨海默病小鼠記憶能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠游泳距離延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；而與模型組比較，多奈哌齊組和通天草醇提物高、中劑量組小鼠游泳距離明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 通天草醇提物對阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶保持能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠在目標(biāo)停留時間明顯縮短，跨躍平臺次數(shù)也顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和通天草醇提物高、中劑量組小鼠目標(biāo)停留時間則明顯延長，跨躍平臺次數(shù)也明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

2.4 通天草醇提物對阿爾茨海默病小鼠海馬炎癥介質(zhì)的影響

與正常組比較，模型組小鼠海馬IL-1β、TNF-α含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和通天草醇提物高、中劑量組小鼠IL-1β、TNF-α含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表4。

3 討論

阿爾茨海默病初期會有學(xué)習(xí)記憶能力減退，腦組織有淀粉樣物的沉積，其機體腦組織小膠質(zhì)細胞吞噬β-淀粉樣蛋白，隨著β-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生而隨之增加，小膠質(zhì)細胞吞噬作用減弱，逐漸激活小膠質(zhì)細胞的分泌能力，繼而產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，反過來激活小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生放大效應(yīng)，促進β-淀粉樣蛋白增加，進而加速阿爾茨海默病進程[24-27]。

本研究水迷宮實驗顯示，模型組小鼠的潛伏期及游泳距離增加，同時伴有目標(biāo)停留時間縮短和跨平臺次數(shù)減少，尋找到水迷宮系統(tǒng)水下平臺所需要時間較長，說明模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退，動物實驗?zāi)Ｐ徒⒊晒捎糜诤罄m(xù)實驗。而經(jīng)過通天草醇提物藥物治療后，高、中劑量組小鼠與模型組相比逃避潛伏期明顯縮短，游泳距離減少，目標(biāo)停留時間則明顯延長，跨躍平臺次數(shù)也提高，可促使模型組小鼠較快地尋找到水迷宮水下平臺，預(yù)示著通天草醇提物高、中劑量可以改善阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，對其行為學(xué)具有改善作用。本研究還檢測了阿爾茨海默病小鼠海馬中炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α的含量，結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬IL-1β、TNF-α含量增加，而通天草醇提物治療后，其高、中劑量可下調(diào)小鼠海馬IL-1β、TNF-α含量，對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用，提示通天草醇提物高、中劑量可以改善小鼠的行為學(xué)，這可能與小鼠海馬炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α含量的降低有關(guān)。

綜上所述，通天草醇提物能夠改善小鼠學(xué)習(xí)能力和記憶障礙，降低炎性反應(yīng)，并緩解血腦屏障損傷，以此在阿爾茨海默病治療中發(fā)揮重要作用。

[參考文獻]

[1] Yilmaz U. Alzheimer′s disease [J]. Radiologe，2015，55（5）：386-388.

[2] Li M，Guo K，Ikehara S. Stem cell treatment for Alzheimer′s disease [J]. Int J Mol Sci，2014，15（10）：19226-19238.

[3] Zhang ZX，Zhao RP，Wang DS，et al. Fuzhisan Ameliorates the Memory Deficits in Aged SAMP8 Mice via Decreasing Aβ Production and Tau Hyperphosphor rylation of the Hippocampus [J]. Neurochem Res，2016，41（11）：3074-3082.

[4] Salemme A，Togna AR，Mastrofrancesco A，et al. Anti-inflammatory effects and antioxidant activity of dihydroasparagusic acid in lipopolysaccharide-activated microglial cells [J]. Brain Res Bull，2016，120：151-158.

[5] Valero J，Bernardino L，Cardoso FL，et al. Impact of Neuroinflammation on Hippocampal Neurogenesis：Relevance to Aging and Alzheimer′s Disease [J]. J Alzheimers Dis，2017，60（1）：S161-S168.

[6] Horgusluoglu E，Nudelman K，Nho K，et al. Adult neurogenesis and neurodegenerative diseases：A systems biology perspective [J]. Am J MedGenet B Neuropsychiatr Genet，2017，174（1）：93-112.

[7] Erickson MA，Banks WA. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer′s disease [J]. J Cereb Blood Flow Metab，2013，33（10）：1500-1513.

[8] Di Marco LY，F(xiàn)arkas E，Martin C，et al. Is Vasomotion in Cerebral Arteries Impaired in Alzheimer's Disease [J]. J Alzheimers Dis，2015，46（1）：35-53.

[9] 周天，費洪新，田冰，等.通天草水提物對APP/PSI雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬IL-β和TNF-α水平影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016，18（3）：10-14.

[10] 費洪新，韓玉生，杜徽，等.補陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠海馬形態(tài)學(xué)和β淀粉樣蛋白水平的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（23）：142-145.

[11] 費洪新，周忠光，劉旭，等.補陽還五湯對阿爾茨海默病模型小鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡的影響[J].中國醫(yī)學(xué)裝備，2014，11（S2）：427-429.

[12] 費洪新，周忠光，劉斌.補陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠NF-κB p65蛋白的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2015， 35（19）：5369-5371.

[13] 費洪新，周忠光，韓玉生，等.補陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠血腦屏障通透性的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2015， 26（5）：1028-1031.

[14] 費洪新，周忠光，姜波，等.補陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬β淀粉樣前體蛋白的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（20）：125-128.

[15] Wang F，Liu H，Shen X，et al. The combined treatment of amyloid β1-42 stimulated bone marrow derived dendritic cells plus splenocytes from young mice prevents the developme nt of Alzheimer disease in APPswe/PSENJE 9 mice [J]. Neurobiol Aging，2015，36（1）：111-122.

[16] 王睿，費洪新，王琪，等.補陽還五湯對慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激抑郁模型小鼠行為及腦海馬CA3區(qū)病理形態(tài)學(xué)影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2017，23（1）：158-162.

[17] 張英博，費洪新，郭家，等.蝙蝠葛堿對阿爾茨海默病小鼠海馬晚期糖基化終產(chǎn)物受體和核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2017，37（19）：4697-4700.

[18] 費洪新，高音，張英博，等.蝙蝠葛蘇林堿對阿爾茨海默病小鼠海馬的影響和機制[J].中國老年學(xué)雜志，2017， 37（1）：9-12.

[19] 費洪新，韓玉生，仲麗麗，等.補陽還五湯對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬組織白介素-6水平的影響[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，43（8）：677-681.

[20] 姜波，費洪新，仲麗麗，等.黃芪多糖對阿爾茨海默病大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1水平的影響[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016，3（32）：451-454.

[21] 費洪新，高音，孫麗慧，等.蝙蝠葛酚性堿對阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（7）：91-94.

[22] 魏鐵花，李寶龍，劉旭，等.通天草提取物對擬阿爾茨海默氏病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及其海馬區(qū)組織相關(guān)蛋白表達的影響[J].吉林中醫(yī)藥，2013，33（2）：179-181.

[23] Zhou ZG，Zhang CY，F(xiàn)ei HX，et al. Phenolic alkaloids from Menispermum dauricum inhibits BxPC-3 pancreatic cancer cells by blocking of Hedgehog signaling pathway [J]. Pharmacognosy Magazine，2015，11（44）：690-697.

[24] 黎冰林，盧鑫，李江超，等.阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因模型Tg2576小鼠血清的代謝組學(xué)研究[J].中國實驗動物學(xué)報，2017，25（2）：218-224.

[25] 張春梅.補陽還五湯治療阿爾茨海默病的療效及對MMSE積分、ADL評分的影響研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（31）：126-128.

[26] 黃雅蘭，黃江，宋大強，等.積雪草苷對阿爾茨海默病模型大鼠海馬組織中PPAR-γ蛋白表達的影響[J].中國藥房，2016，27（34）：4791-4793，4794.

[27] 趙進，蔡兆偉，管峰，等.阿爾茨海默病與PRNP突變體小鼠動物模型[J].中國實驗動物學(xué)報，2016，24（5）：541-545.

（收稿日期：2018-03-09 本文編輯：張瑜杰）