蘆薈活性提取物對腐敗希瓦氏菌的抑制機(jī)理研究

余友恒 馬堃 王艷奇

摘要 為了研究庫拉索蘆薈活性成分對腐敗希瓦氏菌的抑制作用，采用瓊脂打孔法，測定了在不同處理?xiàng)l件下的蘆薈活性成分對腐敗希瓦氏菌的抑菌活性。結(jié)果表明，蘆薈中存在的活性成分能夠有效抑制腐敗希瓦氏菌的生長，其MIC為20%；抑菌效果在20～80 ℃范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，60 ℃處理后抑菌效果最佳；當(dāng)pH值處于5～9時(shí)，抑菌圈直徑在10.9～12.1 mm范圍內(nèi)，因而蘆薈活性物能夠穩(wěn)定抑菌；通過微生物生長曲線以及其電導(dǎo)率的測定，進(jìn)一步證明了蘆薈活性提取物對腐敗希瓦氏菌的生長有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞 庫拉索蘆薈；活性提取物；腐敗希瓦氏菌；瓊脂打孔法；抑菌

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）19-0265-02

Abstract In order to study the inhibitory effect of active compsonents of aloe vera against Shewanella putrefaciens，the inhibitory activity of active components of aloe against Shewanella putrefaciens was determined by agar perforation method.The results showed that the active components of aloe vera could effectively inhibit the growth of Shewanella putrefaciens，its MIC was 20%；the bacteriostatic effect was stable when the temperature was 20-80 ℃，and the best was at 60 ℃.The diameter of bacteriostatic circle was within 10.9-12.1 mm，when the pH value was 5-9，so the active components of aloe vera could stabilize the bacteriostatic activity.It was further proved that the active extracts of aloe vera had a certain inhibitory effect on the growth of Shewanella putrefaciens by the microorganism growth curve and the determination of conductivity.

Key words aloe vera；active extract；Shewanella putrefaciens；agar perforation method；bacteriostasis

蘆薈為多年生、常綠、多肉質(zhì)草本植物。蘆薈的種類繁多，其中庫拉索蘆薈、好望角蘆薈、木立蘆薈、開普蘆薈被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、美容與食用等領(lǐng)域[1]。本試驗(yàn)選用庫拉索蘆薈（Aloe barbadensis Miller）為試驗(yàn)材料。庫拉索蘆薈也稱美國翠葉蘆薈，其葉大肥厚、膠質(zhì)豐富、品質(zhì)優(yōu)秀，是有益于藥食應(yīng)用的品種之一[2]。蘆薈的主要成分為蘆薈大黃素甙、異蘆薈大黃素甙、蘆薈甙等，而蘆薈中的蘆薈酊有著很強(qiáng)的抗菌性，不僅能殺滅真菌、霉菌、細(xì)菌、病毒，還能抑制、消滅病原體發(fā)育繁殖[3-5]。本試驗(yàn)以海產(chǎn)品中常見菌腐敗希瓦氏菌為研究對象，測定了在不同pH值、溫度處理?xiàng)l件下蘆薈活性成分對腐敗希瓦氏菌的抑制效果，再通過測繪加入蘆薈汁的菌體生長曲線和電導(dǎo)率曲線來探索蘆薈提取物作為抑菌劑在水產(chǎn)方面應(yīng)用的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試材料與試劑。庫拉索蘆薈（購于大連市港西花卉城）；黃花魚（用于腐敗希瓦氏菌的提取，購于遼寧大連市場）；LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；NaCl（AR級）、HCl（AR級）、NaOH（AR級）、無水乙醇（AR級）、助濾劑活性炭（AR級）、食品添加劑VC（AR級）。

1.1.2 儀器。試驗(yàn)儀器包括CJ-1680超凈工作臺、JA-2003型電子分析天平、恒溫培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌器、UV-2550紫外分光光度計(jì)、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、DDS-307A 型電導(dǎo)率儀、PHS-3C型酸度計(jì)、離心機(jī)、勻漿機(jī)、搖床以及實(shí)驗(yàn)室其他常規(guī)儀器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 腐敗希瓦氏菌的獲取。獲取流程：采樣（腐敗黃花魚）→增殖培養(yǎng)→純種分離→初篩→復(fù)篩→保存菌株（斜面保存）待用。

1.2.2 蘆薈汁的準(zhǔn)備。選取新鮮健康的庫拉索蘆薈葉片洗凈→果肉燙熱→勻漿→加入助濾劑活性炭（1 g/100 mL）→離心過濾（3 000 r/min，20 min）→加入食品添加劑VC→蘆薈原汁→4 ℃低溫保存?zhèn)溆肹6-9]。

1.2.3 抑菌試驗(yàn)。采用牛津杯法[7]測定蘆薈汁對腐敗希瓦氏菌的抑制效果。取適量腐敗希瓦氏菌接種于LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，過夜振搖培養(yǎng)（30 ℃，100 r/min），從中吸取50 ？滋L 接種于營養(yǎng)肉湯，在30 ℃、100 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)6 h，得到腐敗希瓦氏菌。無菌條件下，將LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后加入適量菌懸液，均勻涂布于培養(yǎng)基表面，30 ℃恒溫培養(yǎng)15 min。用無菌鑷子將直徑為9 mm的牛津杯置于含菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中包含2個(gè)牛津杯，向牛津杯內(nèi)加樣150 ？滋L；其中以牛津杯加生理鹽水為陰性對照（CK）。將培養(yǎng)皿置于30 ℃培養(yǎng)12 h，取出后測量并記錄抑菌圈直徑。

1.2.4 瓊脂打孔法測定最低抑菌濃度（MIC）。滅菌培養(yǎng)基溫度降低到60 ℃后，搖勻，快速倒入培養(yǎng)皿中，其中每個(gè)培養(yǎng)皿盛裝培養(yǎng)基 15～20 mL。待冷卻凝固后，加入適量菌懸液并均勻涂布于培養(yǎng)基表面，30 ℃條件下培養(yǎng)15 min。蘆薈汁分別稀釋為100%、80%、60%、40%、20%、10%以備用。用100 ？滋L滅菌的移液器槍頭，在同一培養(yǎng)皿中間隔均勻地打3個(gè)孔，用無菌針頭挑出瓊脂孔中的培養(yǎng)基。各孔中心之間相距 ≥25 mm，與培養(yǎng)皿的周緣距離≥15 mm。分別吸取20 ？滋L不同濃度的蘆薈汁加入瓊脂孔內(nèi)（3個(gè)孔為一組），以無菌水為空白對照。蓋好培養(yǎng)皿，移入30 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12 h后取出觀察菌的生長情況并記錄，3次重復(fù)。

1.2.5 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。取出適量濃度為100%的蘆薈汁，分為5個(gè)等份。分別于20、40、60、80、100 ℃條件下恒溫水浴處理20 min。以5種溫度處理蘆薈汁后，采用瓊脂打孔法測抑菌圈直徑，3次重復(fù)。

1.2.6 不同pH值對蘆薈活性物抑菌效果的影響。取適量濃度為100%的蘆薈汁6個(gè)等份。將NaOH（1 mol/L）和HCl（1 mol/L）分別調(diào)配成4～5、5～6、6～7、7～8、8～9與9～10等6個(gè)pH值區(qū)間，采用瓊脂打孔法觀測pH值對蘆薈活性物抑菌活性的影響。3次重復(fù)，試驗(yàn)取平均值。

1.2.7 生長曲線的測定。取適量腐敗希瓦氏菌，接種于LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，過夜振蕩培養(yǎng)（30 ℃，100 r/min）。從此培養(yǎng)基中吸取菌液50 ？滋L，滴入新的LB營養(yǎng)肉湯于30 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，得到腐敗希瓦氏菌懸液。取少量菌液過夜培養(yǎng)至對數(shù)期，加入適量蘆薈汁溶液使其濃度為原液的20%作為試驗(yàn)組，同等條件下加入無菌水分作為對照組，搖床培養(yǎng)（30 ℃，100 r/min）。分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h取樣，并在600 nm處測OD值。

1.2.8 菌液電導(dǎo)率的測定。取少量菌懸液培養(yǎng)至對數(shù)期的試驗(yàn)菌，加入適量蘆薈汁原液（其濃度為原液濃度的20%）作為試驗(yàn)組，同等條件下加入無菌水分作為對照組，搖床培養(yǎng)（30 ℃，100 r/min）。分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h取樣測其電導(dǎo)率，參考藍(lán)蔚青等[10]的方法確定金屬離子滲出的變化趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌試驗(yàn)

由表1可知，蘆薈汁對腐敗希瓦氏菌的生長存在抑制作用，其中加入蘆薈汁原液的抑菌圈直徑最大，可達(dá)10.2 mm。隨著蘆薈汁濃度降低，移取相同體積，其抑菌圈直徑減小。當(dāng)蘆薈提取液濃度<20%時(shí)，蘆薈汁對腐敗希瓦氏菌無抑制效果，即MIC為20%。

2.2 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

如圖1所示，蘆薈原液在5種不同溫度條件處理20 min后，抑菌效果在溫度20～80 ℃范圍內(nèi)較為穩(wěn)定；60 ℃的抑菌效果最佳；繼續(xù)升高溫度，蘆薈提取液的活性迅速降低，故適宜溫度范圍是（60±20）℃?？梢?，溫度對蘆薈提取液的活性成分有影響，溫度過高使抑菌活性受限。

2.3 不同pH值對蘆薈活性物抑菌效果的影響

如圖2所示，當(dāng)pH值處于5～9時(shí)，抑菌圈直徑在10.9～12.1 mm范圍內(nèi)；pH值為4.5時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大，為19.6 mm。由此可見，蘆薈活性物處于酸性環(huán)境下能更好地影響菌體的生長，但是不排除微酸環(huán)境本身對菌也有一定的抑制作用。

2.4 腐敗希瓦氏菌生長曲線

采用比濁法測定腐敗希瓦氏菌生長曲線。因?yàn)榫鷳乙旱臐舛扰c其吸光度值成正比，可利用分光光度計(jì)測得菌懸液的光密度（OD600值）與其對應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪制該菌在一定條件下的生長曲線。如圖3所示，加入20%蘆薈汁的試驗(yàn)組OD600值始終小于未加抑菌劑培養(yǎng)的對照組OD600值。從試驗(yàn)組來看，其在培養(yǎng)20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，而對照組在培養(yǎng)18 h后就進(jìn)入穩(wěn)定期。綜上，蘆薈汁的加入抑制腐敗希瓦氏菌的生長，即蘆薈提取液中活性成分對腐敗希瓦氏菌有抑制作用。

2.5 菌液電導(dǎo)率

細(xì)胞膜的重要功能為選擇透過物質(zhì)，當(dāng)細(xì)菌處于非自然生存環(huán)境時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞膜會遭到破壞，流動性降低并且喪失選擇透過性，細(xì)胞的保護(hù)膜被破壞導(dǎo)致內(nèi)部電解質(zhì)（如K+、Na2+）大量流出，使培養(yǎng)液的電導(dǎo)率發(fā)生改變。故通過菌液電導(dǎo)率的變化可反映細(xì)菌膜的受損情況。如圖4所示，加入蘆薈活性物的試驗(yàn)組的電導(dǎo)率明顯高于對照組，因而可以推斷蘆薈活性物能破壞腐敗希瓦氏菌菌體細(xì)胞膜，使電解質(zhì)外滲，對菌體有抑制作用。

3 結(jié)論

試驗(yàn)探究了蘆薈汁對腐敗希瓦氏菌的抑制機(jī)制。結(jié)果表明，蘆薈含有活性成分，能抑制腐敗希瓦氏菌，其MIC為20%。蘆薈原液在5種不同溫度條件下處理20 min后，抑菌效果小幅度上升，抑菌效果受限值域?yàn)椋?0±20）℃。不同pH值處理后，蘆薈提取物處于酸性環(huán)境下能更好地影響菌體生長，當(dāng)pH值處于5～9時(shí)，抑菌圈直徑在10.9～12.1 mm范圍內(nèi)，即蘆薈提取物能夠穩(wěn)定抑制腐敗希瓦氏菌；當(dāng)pH值為4.5時(shí)抑菌效果最好，但不排除酸性環(huán)境對腐敗希瓦氏菌的影響。

腐敗希瓦氏菌生長曲線測定結(jié)果顯示，加入20%蘆薈汁的試驗(yàn)組OD600值始終小于未添加蘆薈汁正常培養(yǎng)的對照組OD600值，就試驗(yàn)組來看，其在培養(yǎng)20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，而對照組在培養(yǎng)18 h后就進(jìn)入穩(wěn)定期；且加入蘆薈汁的試驗(yàn)組電導(dǎo)率高于對照組，即蘆薈提取物使腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜被破壞、離子外滲，從而對菌體有抑制作用。綜上，蘆薈活性成分對腐敗希瓦氏菌具有抑制作用，能夠影響腐敗希瓦氏菌菌體生長繁殖。

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