地奧司明預處理對新西蘭白兔移植供心的保護作用

鄭興,吳兆紅,黃達德,陳敏東,謝建將,白文杰

(1廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院,廣州510150;2廣州市第一人民醫(yī)院)

心臟移植是心臟衰竭最有效的治療方法之一，供心心肌保護是手術成功的關鍵也是當前研究熱點。科技進步為供心保護提供了多種方法，1987年Grobben等[1]開始用含氧或含血停搏液保護供心細胞。Eltzschig等[2]提出遠端缺血預處理概念并用以保護靶器官缺血再灌注損傷。2005年歐美多家心臟中心開展供心不停跳保存保護移植供心。眾多供心保護方法中，藥物預處理可控性和安全性較高。許多研究發(fā)現(xiàn)藥物預處理在抗心肌缺血再灌注損傷方面有良好效果，具有良好臨床應用前景。已經(jīng)證實預處理對移植供心有保護作用的藥物有單磷酰酯A、三磷酸腺苷敏感性鉀通道開放劑(KATPCOs)、吸入性麻藥和阿片類麻醉藥、腺苷等。地奧司明具有清除自由基、抗脂質及舒張血管作用[3，4]，其預處理已被證實對腎、腦等器官缺血再灌注損傷有保護作用，但未見對心臟移植中供心保護作用的報道。2016年1～12月，我們以新西蘭白兔為實驗動物，建立對照組、地奧司明預處理組和地奧司明加超氧化物歧化酶(SOD)抑制劑二乙基二硫代氨基甲酸鈉(DDTC)預處理組，對比各組心肌酶、凋亡指數(shù)、心肌組織含水量，并觀察鏡下心肌組織，探討地奧司明預處理對移植供心的保護作用及其機制，為地奧司明預處理的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 成年健康新西蘭白兔36只，雌雄不限，體質量(2.5±0.5)kg，實驗動物由廣東省實驗動物中心提供，在廣州市第一人民醫(yī)院動物實驗中心統(tǒng)一飼養(yǎng)。主要試劑和儀器： DDTC溶液(西格瑪奧德里奇公司，按1 g DDTC溶于10 mL生理鹽水配制)，TUNEL試劑盒(promega公司)，起搏器(5348型，美國Medtronic)，血氣分析儀(i-stati型，美國Abbott)，光學顯微鏡(CX41，日本Olympus)，小動物呼吸機(江西特力公司)，除顫及心電監(jiān)護儀(LD-9型，美國PHYSIO-CONTROL)，生物組織石蠟包埋機(武漢俊杰電子公司)，組織切片機(Shandon)，圖像分析系統(tǒng)(重慶天海醫(yī)療設備有限公司)，自動生化分析儀(Cobas 6000，美國羅氏)，磷酸肌酸同工酶MB檢測試劑盒、高敏肌鈣蛋白T檢測試劑盒、肌紅蛋白檢測試劑盒(美國羅氏)。

1.2 供心摘取 供體兔稱重，腹腔注射50 mg/kg苯巴比妥鈉,麻醉成功后，行氣管切開插管，插管深度3 cm，接小動物呼吸機(參數(shù)設置：容量控制、氧濃度40%～50%、潮氣量8 ml/kg、呼吸頻率23次/min)。正中開胸，游離心臟大血管，右房全身肝素化(400 U/kg),阻斷主動脈并灌注改良Stanford停搏液(15 mL/kg，4 ℃),灌注完畢后取心，結扎修剪心臟血管，置于改良Stanford停搏液中(4 ℃)保存2 h。

1.3 分組及處理 實驗動物隨機抽樣分為對照組、地奧司明預處理組、地奧司明+DDCT預處理組，每組12只。各組內(nèi)再次隨機抽樣分為6亞組，組內(nèi)隨機分配抽出供體、受體。分組結果：對照組(n=12，供體、受體各6只)；地奧司明預處理組(n=12，供體、受體各6只)；地奧司明+DDTC預處理組(n=12，供體、受體各6只)。對照組正常飲食。地奧司明預處理組在實驗開始前10 d予以地奧司明(80 mg/kg)灌胃，2次/d。地奧司明+DDCT預處理組在實驗開始前10 d予以地奧司明(80 mg/kg)灌胃，2次/d，并在行同種異位心移植前15 min，于兔耳緣靜注射DDTC(300 mg/kg)。受體麻醉、氣管插管同供體。建立耳緣靜脈補液通道，耳緣靜脈采血2 mL送檢。然后行改良Ono’s異位心移植術(股動靜脈處行同種異位心臟移植術)。具體操作：受體右側腹股溝中點做長4 cm切口，顯露并游離股動、靜脈；修剪醫(yī)用輸液管道(保留轉換接頭部分)，管道段分別插入并結扎固定于已修剪完成的供心主動脈和肺動脈端；留置針(BD公司，24 G)插入受體股動、靜脈，并用7號線打結固定；取出供心并充分擠壓供心排盡左心室氣體，開放股動脈血管鉗，將主動脈轉換接頭與股動脈留置針銜接，并旋轉固定，肺動脈轉換接頭與股靜脈留置針銜接并旋轉固定。心臟復跳30、60、90 min于耳緣靜脈通道處采血2 mL送檢，心臟復跳2 h后取下供心結束實驗。

1.4 心肌細胞結構的觀察 實驗結束后立刻在移植供心左心室縱軸取厚約2 mm的心肌組織，對標本進行石蠟包埋、切片、脫蠟至水、染色、脫水及透明處理、封片后，光鏡下觀察供心心肌細胞結構。同樣取材方式取心肌組織標本，立刻置于4 ℃、2.5%戊二醛中進行固定操作，然后50%～100%乙醇多級脫水，后用環(huán)氧樹脂進行包埋，超薄切片和醋酸鈾染色，透射電鏡觀察。

1.5 心肌酶指標的檢測 受體新西蘭兔移植前，移植后30、60、90 min，分別于耳緣靜脈補液通路采靜脈血2 mL，低溫保存，2 h內(nèi)使用本院全自動血液生化儀測定肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白I(cTnI)、肌紅蛋白(MYO)。

1.6 供心左室心肌組織含水量檢測 供心移植并成功復跳后2 h，取下供心，在供心左心室心尖部用眼科剪剪取部分心肌組織，試紙拭干心肌組織標本表面水分，稱取心肌組織標本濕重并記錄。然后將心肌組織標本放置于電熱恒溫鼓風干燥箱里，65 ℃恒溫干燥24 h，最后稱取心肌組織標本干重并記錄。按心肌組織含水量計算公式[含水量=(心肌組織濕質量-干質量)÷心肌組織濕質量×100%]計算心肌組織含水量。

1.7 心肌細胞凋亡指數(shù)(AI)檢測 用光學顯微鏡觀察標本。細胞核中存在褐色顆粒物的為凋亡心肌細胞。每份標本觀察3張切片，每個切片隨機選擇5個視野計數(shù)，在400倍顯光學微鏡下計算標本切片的凋亡心肌細胞和正常心肌細胞個數(shù)。AI=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)。

2 結果

2.1 各組肉眼觀察結果 本實驗研究進行移植手術19例，失敗1例，改良Ono’s模型建立成功率94.74%，移植吻合用時(5±2)min。失敗實驗受體尸體解剖可見氣管黏膜大片斑片樣出血灶，考慮致死原因為呼吸道出血引起氣道梗阻。移植供心自動復跳，竇性心律，心率110～150次/min，收縮力良好。供心肉眼觀察：地奧司明預處理組較對照組、地奧司明+DDCT預處理組心肌收縮更有力，節(jié)律更好，心肌更紅潤；對照組和地奧司明+DDCT預處理組無明顯區(qū)別。移植供心心功能復灌后半小時達最佳，實驗結束時，心功能均有不同程度下降，具體表現(xiàn)為心臟收縮乏力和心律不齊，其中對照組和地奧司明+DDCT預處理組尤為明顯。

2.2 各組心肌酶比較 移植前各組基礎心肌酶指標差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。復跳后30、60、90 min三組心肌酶指標均升高。地奧司明預處理組心肌酶指標升高幅度均低于另外兩組(P均<0.05)；地奧司明+DDTC預處理組心肌酶指標升高幅度低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

2.3 三組左室心肌組織含水量比較 對照組、地奧司明預處理組、地奧司明預處理+DDCT組左室心肌組織含水量分別為80.8%±1.1%、72.7%±1.5%、79.7%±1.1%，地奧司明預處理組較對照組和地奧司明預處理+DDCT組低(P均<0.01)。地奧司明預處理+DDCT組與對照組比較，P>0.05。

2.4 三組鏡下表現(xiàn) ①光鏡下觀察：地奧司明預處理組：心肌細胞染色良好，形態(tài)接近正常，排列規(guī)則有序，心肌纖維豐富，間隙和結構基本正常，細胞核藍染、大小形態(tài)近正常，胞質呈淡紅染，形態(tài)飽滿。地奧司明+DDTC預處理組：心肌細胞排列欠規(guī)則，結構欠清晰，心肌細胞稍顯肥大，橫紋結構欠清晰，心肌纖維結構稍紊亂、間隙擴大，纖維淡染模糊，心肌間質出現(xiàn)水腫，部分心肌細胞出現(xiàn)變性和不同程度壞死，細胞核溶解、固縮和消失。對照組：心肌細胞普遍呈變性和壞死，細胞結構和排列秩序紊亂，細胞間隙增大且界限模糊，大部分細胞核固縮，個別溶解、消失，胞質溶解呈空泡氣球樣變或網(wǎng)狀改變。②電鏡下觀察：地奧司明預處理組：心肌細胞核大致呈三種形態(tài)：梭形、橢圓形、長桿狀，核膜清晰可見，常染色體為細顆粒狀，異染色體分布在核膜內(nèi)側，肌纖維排列未見紊亂，閏盤、Z帶清晰可見，肌原纖維間有桿狀線粒體和糖原顆粒。線粒體排列均勻，線粒體脊和膜清晰可見，L小管存在兩側肌漿網(wǎng)；地奧司明+DDTC預處理組：細胞核不規(guī)則形，核膜尚且清晰，肌纖維排列接近正常，閏盤、Z帶較模糊，線粒體輕微腫脹，部分出現(xiàn)嵴溶解，糖原顆粒減少；對照組：細胞核呈不規(guī)則形，肌纖維排列紊亂，閏盤、Z帶模糊，線粒體較腫脹，嵴溶解，糖原顆粒顯著減少。

表1 三組不同時間cTnI、CK-MB、肌紅蛋白比較

2.5 三組心肌細胞凋亡指數(shù)比較 對照組、地奧司明預處理組、地奧司明預處理+DDCT組心肌細胞凋亡指數(shù)分別為21.6%±1.3%、7.1%±0.9%、20.3%±1.4%。地奧司明預處理組較對照組和地奧司明預處理+DDCT組低(P均<0.01)；地奧司明+DDCT預處理組凋亡指數(shù)雖然較對照組低，但組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

嚙齒類動物異位心臟模型[5]是研究心臟移植的最佳模型并且應用廣泛。Yildiz等[6]利用小鼠成功進行腹腔異位心移植術(Ono’s術式)，Steurer等[7]用頸部動靜脈完成了小鼠同種異位心移植。腹腔異位心移植模型吻合成功率高、移植供心血供充足，但相對頸部異位心移植模型而言，腹腔異位心移植模型創(chuàng)傷更大、對受體內(nèi)環(huán)境影響更顯著且移植供心觀察不方便。我們在Ono’s術式基礎上對動物模型進行改良，將移植位置從腹腔動靜脈改至股動靜脈，使用動脈留置針套管插管吻合術式，減少受體創(chuàng)傷同時保證供心的吻合成功率和血運。改良Ono’s心臟移植模型具有手術操作簡便，用時短，成功率高，創(chuàng)傷小，對動物生理影響小等優(yōu)點，是最適合研究心臟移植的模型之一，尤其適用于吻合技術不成熟、樣本量大的實驗。本研究采用改良Ono’s心臟移植模型實驗方法，設立對照組、地奧司明預處組、地奧司明+DDCT預處理組，對心臟移植后各組間心肌酶、凋亡指數(shù)、心肌含水量、心肌組織進行對比分析，進行地奧司明預處理對移植供心的保護作用及保護機理的研究。

地奧司明為天然黃酮類衍生物，具有促進靜脈回流和保護血管作用，主要用于痔瘡及慢性靜脈功能不全疾病治療。近年研究發(fā)現(xiàn)，地奧司明預處理具有減少細胞凋亡、抑制炎癥反應、降低氧化應激反應、增高SOD活性等作用[8～10]，對減輕器官缺血再灌注損傷有明確作用。Xiong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，地奧司明預處理可抑制機體炎癥反應，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。袁銘等[12]發(fā)現(xiàn)，地奧司明預處理可提高大鼠體內(nèi)SOD活性，減輕腎臟缺血再灌注損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，地奧司明預處理能減輕移植供心心肌水腫和凋亡壞死，并降低移植后受體心肌酶指標，表明地奧司明預處理對移植供心有保護作用。為探明地奧司明對移植供心保護作用機制，我們建立地奧司明+DDCT預處理組，在供心移植前15 min于受體耳緣靜脈注射SOD抑制劑DDTC，實驗結果得出地奧司明+DDCT預處理組移植供心心肌含水量、心肌細胞凋亡指數(shù)和移植后受體心肌酶指標較地奧司明預處理組高，與對照組相比并無明顯差異，表明地奧司明預處理通過提高機體抗氧自由基作用達到減輕心肌細胞損傷目的，起保護心肌作用。

我們通過實驗，一方面，證實了在抗心肌缺血再灌注損傷方面地奧司明預處理有較好效果，主要通過提高體內(nèi)SOD活性來實現(xiàn)，與學者們早期研究結果相符合；另一方面，擴大了預處理使用的選擇范圍,并為藥物預處理在臨床應用奠定動物實驗基礎。但是，實驗樣本含量較小是本實驗不足之處，接下來我們將進行更大樣本實驗研究來驗證實驗結果。

綜上所述，本實驗證實了改良Ono’s心臟移植模型有效、成功率高，可廣泛應用于動物心臟移植實驗中。地奧司明預處理能降低心臟移植中心肌缺血再灌注損傷，主要是通過提高機體抗氧化作用實現(xiàn)，在臨床應用中具有廣泛前景。