烙灸對激素性股骨頭壞死骨細(xì)胞凋亡與Bcl-2、Caspase-3表達影響的實驗研究

朱 寧 ，許建峰 ，2，馬 奇 ，陳美華 ，馬 川 ，林瑞珠 ，2

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，寧夏銀川750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，寧夏銀川750004）

糖皮質(zhì)激素濫用導(dǎo)致機體骨組織代謝失衡，股骨頭供血失衡致局部缺血壞死、關(guān)節(jié)面塌陷，甚至導(dǎo)致機體骨折發(fā)生的激素性股骨頭缺血性壞死（Steroid induced avascular necrosis of the femoral-Head，SANFH）是臨床多發(fā)病和常見?。?］，占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的50%以上，并呈逐年上升趨勢［2］，但其確切的發(fā)病機制尚未十分清楚［3］。筆者采用特色的回醫(yī)烙灸療法治療SANFH療效確切［4］，烙灸具有補腎通絡(luò)、強筋健骨的作用［5］，可有效延緩股骨頭缺血壞死骨細(xì)胞的凋亡，而骨細(xì)胞凋亡和Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達密切相關(guān)。因此，本實驗通過激素誘導(dǎo)的家兔激素性股骨頭壞死模型，觀察烙灸療法對股骨頭骨細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響，為烙灸療法治療SANFH提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與儀器 實驗用的成年健康家兔24只，體重2.0～3.0 kg，雌雄各半，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（寧）2015-0013，按照SPF級別標(biāo)準(zhǔn)進行管理。CMIAS病理圖像分析系統(tǒng)（北京麥奧迪圖像技術(shù)有限公司）、光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）、DHP-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.1.2 藥品與試劑 SABC免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、Caspase-3免疫組化試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。氨基甲酸乙酯和4%多聚甲醛固定液購于銀川市偉博鑫生物科技有限公司。灸法所用艾絨購于寧夏醫(yī)藥公司（豫鄭食藥監(jiān)械［準(zhǔn)］字2012第127003號）。

1.2 方 法

1.2.1 動物分組與造模 將實驗動物按隨機數(shù)字表法隨機分為空白組8只，模型組8只和烙灸組8只。全部動物均在同等環(huán)境和條件下單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)動物5 d后，采用常巍等［6］的方法，模型組、烙灸組的16只兔均先按10 μg/kg體質(zhì)量靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素2次，2次注射間隔24 h。于第2次注射大腸桿菌內(nèi)毒素后連續(xù)3 d按20 mg/kg體質(zhì)量間隔24 h肌肉注射甲基強的松龍，每次注射前均需稱體重。模型組、烙灸組家兔每只注射青霉素8萬U/kg，慶大霉素4萬U/kg，2次/w，預(yù)防感染。空白組注射等量的生理鹽水替代激素。

1.2.2 干預(yù)方法 烙灸組：造模4 w后開始行烙灸治療，一手掌抓握兔子上背部固定兔子，一手持特制的鐵器灸具分別放置在兔子的“腎俞”穴和髖關(guān)節(jié)局部，烙灸鐵具灸槽內(nèi)放置5 g艾絨點燃，每天1次，每個部位約10 min，發(fā)熱鐵器灸具可使局部皮膚發(fā)紅，治療4 w后進行取材。模型組和空白組：造模4 w后不予任何干預(yù)手段，飼養(yǎng)4 w后進行取材。

1.2.3 實驗取材及標(biāo)本處理 干預(yù)4 w后過量麻醉法處死家兔，取髖外側(cè)切口，暴露關(guān)節(jié)囊內(nèi)的股骨頭，用線鋸切取雙側(cè)股骨頭，沿股骨頭負(fù)重區(qū)冠狀面剖開，取軟骨下區(qū) 1.0 mm×1.5 mm×1.0 mm組織，用10%中性甲醛溶液固定，7%硝酸脫鈣，系列酒精脫水，常規(guī)石臘包埋、切片備用。

1.2.4 觀察指標(biāo) 形態(tài)學(xué)觀察。軟骨下區(qū)所取切片浸入二甲苯脫蠟，系列酒精水化，染H（蘇木素），水洗，1%鹽酸酒精溶液分化，反藍(lán)，水洗，染E（伊紅），水洗，系列酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察股骨頭組織形態(tài)學(xué)變化，并任選5個高倍視野，計算空骨陷窩比例并拍片?？展窍莞C與正常陷窩的比值即為空骨陷窩率。

凋亡細(xì)胞的檢測——TUNEL法［7］。采用原位末端標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL法），原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒參照說明書操作。當(dāng)細(xì)胞核出現(xiàn)黃染顆粒為陽性細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，每張玻片上隨機選擇5個高倍視野，計算其中骨細(xì)胞的總數(shù)和TUNEL陽性骨細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）=（TUNEL 陽性骨細(xì)胞數(shù)/骨細(xì)胞數(shù)）×100%。

Bcl-2、Caspase-3的檢測——免疫組織化學(xué)染色（SABC法）。軟骨下區(qū)所取石蠟切片脫蠟至水；檸檬酸修復(fù)液高壓修復(fù)2～5 min，自然冷卻至室溫；滴加3%H2O2，室溫靜置10 min，PBS洗（3 min×3次）；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體；分別滴加Bcl-2、Caspase-3抗體（1∶100稀釋），4℃過夜，PBS洗（3 min×3次）；滴加二抗（生物素化兔抗鼠IgG），室溫靜置20 min，PBS洗（3 min×3次）；滴加三抗（過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉菌抗生物素蛋白），室溫靜置20 min，PBS洗（3 min×3次）；DAB 顯色 5～10 min，蘇木素復(fù)染；脫水、透明、封片、鏡檢。攝影生物顯微鏡下觀察表達情況，染黃色或棕黃色為陽性，并隨機抽取8個40倍顯微鏡下不重疊視野拍片，使用CMIAS病理圖像分析系統(tǒng)，分別測定Bcl-2、Caspase-3在骨細(xì)胞中的陽性細(xì)胞的灰度值，求出視野表達細(xì)胞所占比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有計量資料采用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組骨細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白組間比較，采用One-Way ANOVA分析，所得數(shù)據(jù)使用SPSS18.0 軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組家兔股骨頭骨組織形態(tài)學(xué)檢查

空白組：可見關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，軟骨細(xì)胞各層次結(jié)構(gòu)清晰；骨小梁排列規(guī)則、致密，骨細(xì)胞核較大位于中央，于骨小梁中清晰可見，可見少量空骨陷窩；成骨細(xì)胞成串排列；骨髓造血細(xì)胞豐富；空骨陷窩率（12.58±1.35）%。模型組：軟骨表面可見多個裂縫，可見大量脫水固縮壞死的軟骨細(xì)胞；很多骨細(xì)胞細(xì)胞核變小，可見骨小梁體積較小，連續(xù)性較差，骨小梁斷裂明顯，骨小梁內(nèi)出現(xiàn)大量空骨陷窩，空骨陷窩率（32.63±5.12）%。烙灸組：關(guān)節(jié)軟骨表面略粗糙，裂隙表淺；可見少量骨小梁斷裂，排列較規(guī)則；骨細(xì)胞形態(tài)基本正常，核清晰可見，位于骨小梁中央；空骨陷窩明顯減少，空骨陷窩率（15.21± 2.79）%，接近空白組。結(jié)果見圖 1。

2.2 各組骨細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

圖1 各組家兔股骨頭骨組織形態(tài)學(xué)檢查

模型組TUNEL陽性骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，凋亡指數(shù)顯著高于空白組，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；烙灸組也出現(xiàn)TUNEL陽性骨細(xì)胞，但凋亡指數(shù)明顯低于模型組，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表1。

表1 3組骨細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 （±s）

表1 3組骨細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 （±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P<0.05

組別 n 凋亡指數(shù)（%）空白組 8 6.14±0.591）模型組 8 39.83±4.27烙灸組 8 17.25±5.362）

2.3 各組Bcl-2、Caspase-3蛋白檢測結(jié)果比較

與空白組比較，模型組Bcl-2蛋白表達明顯降低，Caspase-3蛋白表達明顯升高，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，烙灸組Bcl-2蛋白表達升高，Caspase-3蛋白表達降低，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表2。

表2 3組Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的灰度值比較（±s）

表2 3組Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的灰度值比較（±s）

注：與空白組比較，1）P<0.01；與模型組比較，2）P<0.05

組別 n Bcl-2 Caspase-3空白組 8 232.68±22.85 150.88±13.78模型組 8 168.09±18.661） 226.69±15.671）烙灸組 8 202.79±24.562） 190.19±15.882）

3 討論

SANFH是指因大劑量應(yīng)用激素而造成股骨頭內(nèi)的骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和骨髓造血細(xì)胞等活性成分死亡所引起的病理過程［8］。激素所致骨及軟骨的改變、血液流變學(xué)及血管的變化已逐漸被人們所認(rèn)識，因而，應(yīng)用有確切療效的干預(yù)方案，提高壞死區(qū)域新骨形成及血管再生能力，成為防治SANFH的重點。中醫(yī)藥在股骨頭壞死保髖治療中的作用日益受到重視［9-10］，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中未見股骨頭壞死疾病名稱的記錄，一般將本病歸屬于“骨痿”“骨痹”等范疇。《素問》提出“虛邪之入于身也深，寒與熱相傳……病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛……”，指出本病的病邪多為寒邪、濕邪、熱邪等，“陰勝則陽病”，陽氣受損、致血行瘀滯、瘀阻局部從而出現(xiàn)骨壞死?；蒯t(yī)學(xué)是中華民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的一部分，《回回藥方》［5］是具有中國回回特色的醫(yī)藥大型綜合性醫(yī)著，其“針灸門”專論灸，其中以烙灸［11］所占篇幅最長，論述詳細(xì)，提出“凡一體內(nèi)多有惡潤凝聚以致本體，并其稟氣作壞……必以火灸之，則本體病根盡去”。采用烙灸療法具有溫腎散寒、強筋壯骨的功能，不僅能改善SANFH的臨床癥狀［4］，在本課題組的前期研究中，發(fā)現(xiàn)其對關(guān)節(jié)軟骨退變具有確切療效［12-13］，能夠延緩骨細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞凋亡（Appotosis），又稱程序化細(xì)胞死亡（programmed cell death）［14］，是一種細(xì)胞的生理性死亡形式，具有調(diào)節(jié)表皮、血液、骨等組織細(xì)胞數(shù)量，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用［15-16］。但細(xì)胞凋亡的異常增多或減少會破壞機體的平衡及穩(wěn)定，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。已有文獻證實，過多使用激素可導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡加速［17］。人體骨細(xì)胞是一種比較特別的細(xì)胞，自身骨細(xì)胞的再生速度沒有凋亡速度快則導(dǎo)致骨細(xì)胞數(shù)量上失衡，不能及時進行力學(xué)信號傳遞及細(xì)胞修復(fù)工作，導(dǎo)致機體功能紊亂，形成骨壞死甚至股骨頭塌陷。本研究發(fā)現(xiàn)模型組細(xì)胞凋亡增多，與文獻報導(dǎo)相符。

參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的內(nèi)部因子很多，Bcl-2蛋白家族和胱天蛋白酶（Caspase）家族目前受關(guān)注最多。Bcl-2做為抗凋亡基因代表成員，是第一個被確認(rèn)的能對抗細(xì)胞凋亡的基因，是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的凋亡調(diào)節(jié)因子。定位于線粒體外膜上的Bcl-2可能通過抑制谷胱甘肽的外泄，降低氧化還原狀態(tài)；或者通過介導(dǎo)線粒體外膜通透轉(zhuǎn)運孔孔道復(fù)合體的開放，抑制促凋亡蛋白的釋放；或通過與胱冬肽酶的間接作用而阻止凋亡進程［18］。因此，細(xì)胞凋亡調(diào)控與Bcl-2蛋白水平的高低關(guān)系密切，Bcl-2增高可抑制細(xì)胞凋亡。大劑量激素類藥物抑制Bcl-2蛋白的表達，從而增加細(xì)胞死亡信號的傳輸，導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡加速［19］。

同時細(xì)胞凋亡的發(fā)生也是一個由Caspases家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程，Caspase是一類存在于胞質(zhì)中的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，通過啟動型Caspases的激活，發(fā)揮水解蛋白作用，激活下游效應(yīng)型Caspases，從而影響DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和損傷修復(fù)［20］，導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞死亡。同時Caspase-3作為多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，被活化后的Caspase-3酶解切割DNA依賴的蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶等，從而降解細(xì)胞內(nèi)蛋白［21］。依賴cyt-c的釋放，Caspase-3可作為Caspase級聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者；而Bcl-2家族可通過線粒體途徑介導(dǎo)cyt-c等物質(zhì)釋放，Bcl-2不但可作為Caspase-3的上游調(diào)控參與對其活性的調(diào)節(jié)，還可作為Caspase-3的直接底物作用于Caspase-3的下游，加速凋亡過程［22-23］。

本研究中，糖皮質(zhì)激素的使用造成股骨頭壞死，骨細(xì)胞的Bcl-2、Caspase-3蛋白在不同組別出現(xiàn)不同的變化，模型組與空白組比較，Bcl-2蛋白減少、Caspase-3蛋白增加明顯（P<0.01），說明激素可誘導(dǎo)成熟的骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致活性骨細(xì)胞減少，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松甚至股骨頭壞死的出現(xiàn)。模型組與烙灸組相比，烙灸組中Bcl-2蛋白的相對表達量高于模型組（P<0.05），說明可能通過烙灸的刺激，阻斷細(xì)胞傳輸死亡信號的通路，從而延緩細(xì)胞凋亡。與烙灸組比較，模型組的Caspase-3蛋白表達量增高（P<0.05），烙灸組能下調(diào)該蛋白表達量，說明烙灸可能通過線粒體途徑進行細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

綜上所述，激素所致股骨頭壞死與骨細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表達失調(diào)相關(guān)，而烙灸可以上調(diào)骨細(xì)胞Bcl-2、下調(diào)Caspase-3蛋白表達相對量，提示烙灸可能通過線粒體途徑進行細(xì)胞凋亡的調(diào)控來達到防治股骨頭壞死的目的。