葡萄籽提取物對(duì)PC12神經(jīng)元毒性的研究

楊智超，宋麗娟，姜維佳，宋俊麗，王 青

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西太原030024； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，山西太原030001）

葡萄籽提取物（grape seed extract，GSE）是從葡萄籽里提取到的天然產(chǎn)物，富含黃酮類化合物，此黃酮類化合物主要包括黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)的兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒(méi)食子酸酯，以及由黃烷-3-醇通過(guò)碳-碳鍵結(jié)合聚合而成的原花青素［1-2］。原花青素根據(jù)聚合度的不同分為原花青素高聚體（polymeric proanthocyanidin，PPCs）和原花青素低聚體（oligomeric proanthocyanidin，OPCs）。原花青素單聚體和二聚體生物活性最強(qiáng)，具有透過(guò)血腦屏障的優(yōu)良特性，能順利到達(dá)中樞病灶部位，為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ?-4］。

除葡萄籽外，綠茶、巧克力、可可和多種水果當(dāng)中都含有大量的黃烷醇類化合物和原花青素。而大量的文獻(xiàn)報(bào)道也證明了這些黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、抗炎和免疫調(diào)節(jié)的能力，還可以通過(guò)降低血管的通透性和脆性，防止血管損傷［5-7］。流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果也顯示，食用黃烷醇類和花青素類營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑可以大大降低冠心病和腦卒中的發(fā)病率［8-9］。而且原花青素還可以保護(hù)氧化應(yīng)激引起的胃黏膜和膠質(zhì)細(xì)胞損傷。綜上所述，由于這些黃酮類化合物對(duì)身體健康的潛在益處，使其受到了廣泛關(guān)注，但這些化合物的安全性還需要考察。本實(shí)驗(yàn)研究了葡萄籽提取物及其主要成分對(duì)PC12神經(jīng)元細(xì)胞的毒性，為其在神經(jīng)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CO2培養(yǎng)箱（Thermo），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，小型垂直電泳槽（Bio-Rad），小型半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad），小型基礎(chǔ)通用電源（Bio-Rad），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad），DMEM培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（HyClone），噻唑藍(lán)（碧云天），PVDF膜（milipore），BCA試劑盒（碧云天），RAPI細(xì)胞裂解液（碧云天），ECL（碧云天），小鼠Bcl-2抗體（Bioworld），小鼠Bax抗體（Bioworld），辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（康為世紀(jì)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn) 用含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)高分化的PC12神經(jīng)元細(xì)胞，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加5×105/mL 細(xì)胞 100 μL 培養(yǎng)12 h；濃度為 2.5 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，30 μg/mL，50 μg/mL 和 100 μg/mL 的葡萄籽總提物分別孵育PC12神經(jīng)元24 h、48 h和72 h，每孔加10 μL 5%MTT 培養(yǎng) 4 h，每孔加入 100 μL DMSO溶解，采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀以490 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定其OD值。空白對(duì)照組為等體積的培養(yǎng)液。1.2.2 Western Blot實(shí)驗(yàn) PC12神經(jīng)元細(xì)胞用30 μg/mL的葡萄籽總提物孵育24 h后，收集細(xì)胞加入RAPI細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，蛋白濃度用BCA試劑盒檢測(cè)。蛋白上樣量為20 μg，12%的聚丙烯酰胺凝膠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果用（±s）表示。單因素方差分析（One-WayANOVA）后用Dunnett′s test分析比較組間差異。兩組間比較采用T-test法。

2 結(jié)果

2.1 PC-12神經(jīng)元細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

葡萄籽提取物（2.5 μg/mL 和 10 μg/mL）隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，可以促進(jìn)PC12細(xì)胞的增殖，而10 μg/mL的葡萄籽提取物對(duì)PC-12神經(jīng)元增殖無(wú)影響。20 μg/mL的葡萄籽提取物作用48 h后表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性。30 μg/mL，50 μg/mL 和 100 μg/mL作用24 h就可顯著抑制PC-12細(xì)胞的增殖。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 GSE對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響

2.2 30 μg/mL GSE對(duì) PC-12神經(jīng)元 Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

30 μg/mL葡萄籽提取物作用24 h，可以減少抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)，而對(duì)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)無(wú)影響。結(jié)果見(jiàn)圖2。

3 討 論

圖2 30 μg/mL GSE對(duì)PC-12神經(jīng)元Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

本研究顯示低濃度（2.5 μg/mL，5 μg/mL）的葡萄籽提取物可促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖，10 μg/mL的葡萄籽提取物對(duì)PC12細(xì)胞增殖無(wú)影響，當(dāng)濃度升高到20 μg/mL時(shí)葡萄籽提取物作用48 h可顯著抑制PC12細(xì)胞增殖，而高濃度（30 μg/mL，50 μg/mL和100 μg/mL）的葡萄籽提取物孵育24 h就能顯著抑制PC12細(xì)胞增殖。由此可見(jiàn)，低劑量、長(zhǎng)期作用的葡萄籽提取物無(wú)細(xì)胞毒性，但隨著劑量增加表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性。提示，葡萄籽提取物可能含有致細(xì)胞毒性的成分，長(zhǎng)期大量服用可能會(huì)損害人體健康。因此，葡萄籽提取物作為藥品、保健品和化妝品廣泛應(yīng)用的同時(shí)，一定要注意藥物的使用劑量和時(shí)間，以保證用藥安全、有效［10］。

本研究對(duì)葡萄籽提取物細(xì)胞毒性的機(jī)制進(jìn)行了初步探討，細(xì)胞凋亡是受一系列基因控制的程序化的細(xì)胞死亡方式，被內(nèi)源性或外源性的凋亡信號(hào)觸發(fā)后，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)編碼的自殺相關(guān)的凋亡蛋白發(fā)生［11］。Bcl-2蛋白家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一類蛋白，分為抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL等和促凋亡蛋白 Bax、Bak 等［12］。研究證明，Bcl-2 被 Bax絡(luò)合，其抗凋亡作用會(huì)減弱。因此，Bcl-2表達(dá)下調(diào)或Bax蛋白升高均會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，30 μg/mL的葡萄籽提取物可以通過(guò)抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是其產(chǎn)生細(xì)胞毒性的重要作用機(jī)制。

大量文獻(xiàn)報(bào)道，葡萄籽原花青素及其單體成分兒茶素、表兒茶素和原花青素B1等具有較高的食用安全性，急性毒性和慢性長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)均未見(jiàn)毒副作用［10］。葡萄籽原花青素具有可預(yù)防保護(hù)砷致小鼠肝臟毒性，可誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡和保護(hù)化療藥物所致的細(xì)胞損傷等作用［14-16］。因此，葡萄籽提取物日益被各國(guó)廣泛用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑來(lái)使用。但本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽提取物大量使用會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明其中除原花青素外，還含有其他有毒成分。因此，我們?cè)趯?duì)葡萄籽原花青素進(jìn)行限量的同時(shí)，也應(yīng)當(dāng)對(duì)其他成分進(jìn)行質(zhì)控，以保護(hù)藥物能夠安全、有效地在臨床使用。