二甲雙胍對(duì)2型糖尿病合并結(jié)腸癌患者腫瘤組織中β-catenin及CD133表達(dá)的影響

張艷飛，龔錦強(qiáng)，黃柱連

二甲雙胍作為最常用的降糖藥物，多項(xiàng)研究顯示其能夠改善2型糖尿病合并結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，術(shù)后口服二甲雙胍與其他降糖方案相比，死亡率顯著降低。Wnt/β-cateninn 通路的活性在結(jié)直腸癌干細(xì)胞內(nèi)顯著增加，CD133也是結(jié)直腸癌干細(xì)胞的標(biāo)志物之一[1-2]，β-cateninn及 CD133蛋白的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及化療藥物耐藥相關(guān)，提示腫瘤預(yù)后不良[3]。本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測結(jié)腸癌組織中β-cateninn及CD133蛋白的表達(dá)，探討二甲雙胍改善2型糖尿病合并結(jié)直腸癌患者預(yù)后的分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象2010 年 1 月至 2015 年 6 月我院普通外科手術(shù)治療且術(shù)前未進(jìn)行放化療的2型糖尿病合并結(jié)腸癌患者的石蠟標(biāo)本共計(jì)35例，常規(guī)HE染色明確診斷。二甲雙胍組19例(高分化3 例、中分化15例、低分化1 例)，非二甲雙胍組18例(高分化4 例、中分化11例、低分化3例)。同時(shí)收集兩組患者的臨床資料：年齡(歲)、糖尿病病程、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、肌酐(creatinine, CR)、白蛋白(albumin, ALB)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholestrol, HDL-C)。

1.2主要試劑鼠抗人β-catenin 單克隆抗體 (cell signaling technology)，鼠抗人CD133 單克隆抗體 (博奧森生物技術(shù)有限公司)，通用型免疫組化超敏SP 試劑盒、DAB顯色試劑盒、PBS緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液 (均購自中衫金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3免疫組織化學(xué)SP法石蠟標(biāo)本，4 μm厚切片，采用SP法，按試劑盒說明書步驟進(jìn)行抗β-cateninn蛋白及抗CD133(1∶200)抗體免疫組織化學(xué)染色。陽性對(duì)照為已知陽性片，用PBS緩沖液代替一抗作為檢測的陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷β-cateninn蛋白染色結(jié)果的判定：鏡下見棕黃色細(xì)小顆粒為免疫組化陽性表達(dá)的信號(hào)，分析β-catenin 蛋白細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的分布特征：小于70%的癌細(xì)胞胞膜陽性表達(dá)，或者大于10%的癌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核陽性表達(dá)均為陽性，即異常表達(dá)。CD133蛋白的染色結(jié)果的判定：在高倍光學(xué)顯微鏡(×400)下計(jì)數(shù)200 個(gè)癌細(xì)胞，計(jì)算包膜上有棕黃色物質(zhì)細(xì)胞(陽性細(xì)胞)的構(gòu)成比，≥10%為CD133蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞。

2 結(jié)果

組間臨床資料提示二甲雙胍組患者體質(zhì)量指數(shù)略低于非二甲雙胍組，其他指標(biāo)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。二甲雙胍組腫瘤組織中β-cateninn蛋白表達(dá)的陽性率為 36.84%，非二甲雙胍組為72.22%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。二甲雙胍組蛋白表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜上，胞核內(nèi)未見表達(dá)；非二甲雙胍組蛋白廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核內(nèi)，見圖1，表2。二甲雙胍組CD133 蛋白表達(dá)的陽性率為21.05%，非二甲雙胍組為 50.00%。二甲雙胍組癌細(xì)胞巢內(nèi) CD133+ 細(xì)胞比例<10%；非二甲雙胍組癌細(xì)胞巢內(nèi) CD133+ 細(xì)胞比例>10%，見圖2，表2。二甲雙胍組CD133蛋白表達(dá)的陽性率低于非二甲雙胍組，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.07)。由于術(shù)前未進(jìn)行放化療的手術(shù)標(biāo)本量少，無法進(jìn)行相關(guān)分析。

表1 兩組臨床指標(biāo)比較

A：二甲雙胍組；B：非二甲雙胍組。圖1 β-catenin蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)(SP法)

表2 兩組β-cateninn 及CD133蛋白陽性率例(%)

A：二甲雙胍組；B：非二甲雙胍組。圖2 CD133蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)(SP法)

3 討論

結(jié)直腸癌的5 a生存率仍然是徘徊在50%左右，結(jié)腸癌耐藥引起的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是進(jìn)一步提高療效的主要障礙。對(duì)常規(guī)化療藥物耐藥的細(xì)胞多屬于腫瘤干細(xì)胞群[4]。晚期結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)，Wnt/β-cateninn通路活化，胞質(zhì)內(nèi)β-cateninn表達(dá)增加，其在胞質(zhì)內(nèi)累積后，進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子共同作用，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[5]。在裸鼠體內(nèi)運(yùn)用腎被膜移植實(shí)驗(yàn)鑒定的人類直腸癌的起始細(xì)胞(colon cancer initiating cell,CC-IC)，所有的CC-IC均為CD133+。免疫組化檢測顯示，正常的結(jié)腸癌組織中幾乎不表達(dá)CD133蛋白，而在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中CD133蛋白顯著高表達(dá)[7]。CD133是結(jié)直腸癌有效的預(yù)后因素，高表達(dá)說明其預(yù)后不良 。

既往的研究提示二雙胍可以特異性殺傷耐藥的腫瘤干細(xì)胞，同時(shí)抑制腫瘤干細(xì)胞的產(chǎn)生，作為非毒性的抗腫瘤藥，可以與常規(guī)化療藥物發(fā)揮協(xié)同作用。二甲雙胍可以通過降低主要驅(qū)動(dòng)因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減少了乳腺癌干細(xì)胞的發(fā)生[8]。二甲雙胍聯(lián)合索拉非尼可殺傷對(duì)替莫唑胺耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞[9]。阿霉素抑制裸鼠體內(nèi)移植的腫瘤組織(乳腺癌、前列腺癌、肺癌)的生長和復(fù)發(fā)，而二甲雙胍加原劑量的1/4的阿霉素對(duì)腫瘤組織的抑制效果與之前相同[10]。二甲雙胍作用于成骨細(xì)胞后，可以促進(jìn)β-cateninn蛋白的磷酸化降解，進(jìn)而降低胞質(zhì)內(nèi)β-cateninn蛋白水平，抑制了Wnt/β-cateninn通路活性[11]。體外細(xì)胞培養(yǎng)研究證明二甲雙胍可通過下調(diào)Wnt /β-cateninn信號(hào)通路進(jìn)而減少結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥物的耐藥性。

本研究對(duì)二甲雙胍組及非二甲雙胍組的臨床資料進(jìn)行比對(duì)，由于二甲雙胍有減輕體質(zhì)量的作用，兩組間BMI有顯著性差異，其他指標(biāo)均無顯著差異。二甲雙胍組患者腫瘤組織中β-catenin及CD133蛋白的表達(dá)低于非二甲雙胍組。因此，二甲雙胍可能對(duì)結(jié)直腸癌組織中干細(xì)胞具有一定的抑制作用。肥胖是結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)因素，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在飲食誘導(dǎo)肥胖的小鼠結(jié)腸黏膜組織中腫瘤壞死因子-α升高，并引發(fā)Wnt信號(hào)通路內(nèi)關(guān)鍵組分包括β-cateninn蛋白及其下游的靶基因c-myc的表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[12]。因此，二甲雙胍對(duì)體質(zhì)量的影響，也可能是其改善合并2型糖尿病的結(jié)直腸癌患者預(yù)后的機(jī)制之一。由于標(biāo)本數(shù)量有限，本研究具有一定的局限性，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入探討。