siRNA沉默HDAC6對宮頸癌Hela細胞順鉑敏感性的影響

秦海霞，尚翠玲，李少平，朱利紅，張全華，王世進

宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的常見女性惡性腫瘤，嚴重威脅女性生命安全[1]。順鉑是宮頸癌一線化療藥物基石，但由于先天性或獲得性耐藥，使得部分患者無法獲益[2]。組蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)是重要的Ⅱ型組蛋白去乙?；讣易宄蓡T，其通過促多種基因乙?；_到促腫瘤細胞侵襲和遷移的作用[3]。研究表明，HDAC6在宮頸癌組織中高表達，且其表達水平與宮頸癌臨床分期、浸潤程度及淋巴轉移密切相關，提示HDAC6參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展，并且發(fā)揮類似促癌基因的作用[4-5]。抑制HDAC6表達是否可起到抗宮頸癌作用，其對宮頸癌順鉑敏感性的影響又如何均尚未可知。本研究擬利用小分子干擾RNA(small interference RNA,siRNA)技術降低宮頸癌Hela細胞中HDAC6表達，并觀察HDAC6表達變化對宮頸癌順鉑敏感性的影響，以期為宮頸癌分子靶向治療提供理論依據，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料人宮頸癌細胞系Hela購于美國ATCC；DMEM培養(yǎng)基、PBS、胰酶、胎牛血清購于Gibco公司；MTT試劑盒購于博士德生物有限公司；RNA提取試劑盒購于博士德生物有限公司；Lipofectamine TM 2000脂質體購于美國Invitrogen公司；HDAC6單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、β-actin單克隆抗體購于大連Takara公司；細胞凋亡檢測試劑盒購于BD公司；HDAC6 siRNA、Control siRNA由廣州銳博科技有限公司構建。

1.2細胞培養(yǎng)及轉染復蘇Hela細胞，用DMEM培養(yǎng)液(1%雙抗+10%FBS)懸浮細胞，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)。收集對數生長期的Hela細胞并接種于6孔培養(yǎng)板中，然后繼續(xù)置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待貼壁細胞長滿底部面積的40%～50%時進行轉染。細胞隨機分為3組，每組3孔，即空白對照組、Control siRNA組和HDAC6 siRNA組?？瞻讓φ战M加入PBS；Control siRNA組和HDAC6 siRNA組分別轉染Control siRNA和HDAC6 siRNA，轉染操作嚴格按試劑盒說明書進行。轉染結束后繼續(xù)恒溫培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)細胞；轉染后48 h，收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.3RT-PCR法檢測HDAC6表達轉染后各組細胞，與順鉑藥物作用48 h后，收集100 μg·μL-1順鉑處理后的細胞，采用Trizol試劑盒分別提取各組細胞總RNA，逆轉錄總RNA至cDNA，之后取1 μL逆轉錄產物行RT-PCR(SYBR Green法)，以β-actin為內參。HDAC6上游引物序列：5’-AGGTAAAGG-GGAAGAAACAAA-3’；HDAC6下游引物序列：5’-TGCGGATGAGTTGTTTCTGGC-3’。β-actin上游引物序列：5’-CATGTCGAGTTAAGGAGAAGC-3’；β-actin下游引物序列：5’-CTTTTAGTGGAGTGCCACAGG-3’。采用2-ΔΔCt分析法對熒光定量PCR結果進行分析，在獲得每個樣品的Ct值之后求其平均值，隨后再減去各自的內參平均Ct值，以此得到ΔCt。比較兩個樣本間的ΔCt值相減得到ΔΔCt值，隨后求得2-ΔΔCt以得到相對基因表達差異的倍數。

1.4Westernblot法檢測HDAC6蛋白表達收集轉染后各組細胞并提取細胞蛋白，定量蛋白濃度后行SDS-PAGE凝膠電泳，轉至硝酸纖維膜，將膜置于5%封閉液4 ℃封閉4 h，PBS洗滌3次，分別加入HDAC6單克隆抗體(1∶2 000)孵育過夜，PBS洗滌3次，二抗(1∶500)孵育4 h，PBS洗滌3次，按ECL試劑盒說明書行電化學發(fā)光檢測。

1.5流式細胞儀檢測順鉑誘導的細胞凋亡收集轉染細胞，加入順鉑至終濃度100 μg·μL-1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PBS洗滌2次，加入500 μL結合緩沖液重懸細胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL磺化丙啶，室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6MTT法檢測細胞對順鉑敏感性收集轉染細胞，將細胞置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)24 h，分別加入順鉑至終濃度為0、12.5、25、50、100、200 μg·μL-1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后離心棄上清每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液(每孔20 μL)，繼續(xù)37 ℃、5%CO2恒溫繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入100 μL DMSO，振蕩至結晶物充分溶液，采用全自動酶標儀測450 nm處OD值。細胞抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。計算各組細胞對順鉑的50%抑制濃度(inhibitory concentration, IC50)。

1.7順鉑誘導的凋亡基因表達收集轉染后各組細胞，加入順鉑至終濃度100 μg·μL-1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取細胞蛋白。蛋白濃度定量后SDS-PAGE凝膠電泳轉膜，將膜置于5%封閉液4 ℃封閉4 h，PBS洗滌3次，分別加入Bcl-2、Bax單克隆抗體(1∶2 000)孵育過夜，PBS洗滌3次，二抗(1∶500)孵育4 h，PBS洗滌3次，按ECL試劑盒說明書行電化學發(fā)光檢測。目的蛋白相對表達量=目的條帶灰度值/同一樣本內參灰度值。

2 結果

2.1RT-PCR檢測HDAC6mRNA表達HDAC6 siRNA組HDAC6 mRNA表達(82.3±24.5)顯著低于空白對照組(352.7±89.2)及Control siRNA組(361.7±77.6)(均P<0.05)，見圖1。

A:空白對照組；B:control siRNA組；C:HDAC6 siRNA組。①與A組比較，P<0.05；②與B組比較，P<0.05。圖1 RT-PCR法檢測HDAC6 mRNA表達

2.2各組HDAC6蛋白表達HDAC6 siRNA組HDAC6 蛋白表達(118.7±20.9)顯著低于空白對照組(558.4±105.5)及Control siRNA組(564.9±98.5)(均P<0.05)，見圖2。

2.3HDAC6siRNA對凋亡的影響流式細胞術結果顯示，HDAC6 siRNA組細胞凋亡率(37.6±8.7)%，顯著高于空白對照組的(5.8±1.1)%及Control siRNA組的(6.4±1.3)%，見圖3。

2.4HDAC6siRNA的順鉑敏感性不同濃度順鉑作用48 h后，HDAC6 siRNA組細胞存活率顯著低于空白對照組及Control siRNA組(均P<0.05)，見圖4。

A:空白對照組；B:control siRNA組；C:HDAC6 siRNA組。①與A組比較，P<0.05；②與B組比較，P<0.05。圖2 HDAC6 蛋白表達

A:空白對照組；B:control siRNA組；C:HDAC6 siRNA組。①與A組比較，P<0.05；②與B組比較，P<0.05。圖3 各組細胞凋亡率比較

圖4 各組細胞存活率比較

2.5HDAC6siRNA對凋亡基因表達的影響Western blot結果顯示，HDAC6 siRNA組Bcl-2 蛋白表達(179.5±44.6)顯著低于空白對照組(494.1±65.3)及Control siRNA組(487.2±74.1)(P<0.05)，Bax蛋白表達(448.6±70.8)顯著高于空白對照組(189.7±60.3)及Control siRNA組(194.2±68.4)(P<0.05)，見圖5。

A:空白對照組；B:control siRNA組；C:HDAC6 siRNA組。①與A組比較，P<0.05；②與B組比較，P<0.05。圖5 Western blot法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達

3 討論

宮頸癌起病隱匿，大多數患者確診時已為中晚期，即使采用含鉑類藥物化療，患者臨床受益率和癥狀緩解率也不盡人意，其原因與鉑類藥物原發(fā)性及繼發(fā)性耐藥有關[6-7]。因此，探討宮頸癌鉑類耐藥機制是提高宮頸癌化療敏感性和改善臨床預后的關鍵。

組蛋白的乙?；腿ヒ阴；菒盒阅[瘤發(fā)生發(fā)展的基礎。HDCA6屬于微管蛋白去乙?；福ㄎ挥谌巳旧wXp11.23上，由1個鋅指基序和2個功能性去乙?；Y構組成，其可通過依賴性和非依賴性去乙酰化通路調控微管蛋白聚集，促進腫瘤細胞的趨化性運動，從而參與腫瘤細胞的侵襲和遷移[8-10]。Wang等研究顯示，抑制HDAC6表達可促進順鉑誘導的非小細胞肺癌細胞DNA損傷及細胞凋亡，提示HDAC6表達水平高低可能是影響非小細胞肺癌細胞對順鉑的敏感性的重要因素[11]。本組前期研究發(fā)現(xiàn)，利用siRNA技術沉默宮頸癌Hela細胞中HDCA6表達可顯著抑制細胞增殖，同時促進細胞凋亡，其機制與調控細胞增殖相關蛋白p21及細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達有關，提示HDCA6參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展，但其對宮頸癌順鉑敏感性的調控作用尚未可知。本研究結果顯示，HDCA6 siRNA組宮頸癌Hela細胞中HDCA6 mRNA及蛋白表達顯著高于空白對照組及Control siRNA組(均P<0.05)，同時HDCA6 siRNA組IC50值顯著低于空白對照組及Control siRNA組(均P<0.05)，提示利用siRNA技術沉默宮頸癌Hela細胞中HDCA6表達可提高宮頸癌細胞對順鉑的敏感性。

如前所述，HDCA6可調控細胞增殖相關蛋白p21表達，而后者可通過抑制cyclin/cdk2活性負向調控細胞周期進程，其表達缺失已被證實與腫瘤細胞化療耐藥有關。故推測，沉默HDCA6表達可上調細胞增殖相關蛋白p21表達，從而減少宮頸癌細胞對順鉑的耐藥性[12]。此外，流式細胞儀檢測結果顯示，HDCA6 siRNA組Hela細胞凋亡率顯著高于空白對照組及Control siRNA組(均P<0.05)，提示利用siRNA技術沉默宮頸癌Hela細胞中HDCA6表達可促細胞凋亡。進一步分析凋亡基因表達發(fā)現(xiàn)，HDAC6 siRNA組Bcl-2 蛋白表達顯著低于空白對照組及Control siRNA組(均P<0.05)，Bax蛋白表達顯著高于空白對照組及Control siRNA組(均P<0.05)。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比值是決定細胞是否進入凋亡狀態(tài)的關鍵因素。當Bcl-2/Bax平衡傾向Bax亢進時，Bax同源二聚體迅速形成，易于誘導細胞凋亡[13-14]。本研究結果提示，鑒于Bcl-2/Bax在細胞凋亡中的核心調控地位，故推測HDAC6可通過調控Bcl-2/Bax表達，促進細胞凋亡，這可能也是沉默HDAC6表達后宮頸癌細胞順鉑敏感性提高的主要分子作用機制。

綜上所述，利用siRNA技術沉默HDAC6表達可提高宮頸癌Hela細胞對順鉑的敏感性，而促進細胞凋亡可能是其主要作用機制。