銀杏葉復(fù)方對(duì)LPS應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜形態(tài)及上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

李 焰，蘭天香，邱龍新*，林麗萍，戴愛(ài)玲，郭 豪

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖 364000；2. 福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖 364000；3.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建龍巖 364000）

母豬早期斷奶技術(shù)能最大限度提高母豬的生產(chǎn)力及其欄舍利用率，但由于仔豬斷奶時(shí)自身免疫系統(tǒng)尚未完善，在日糧、環(huán)境等外界因素影響下易造成免疫應(yīng)激。應(yīng)激狀態(tài)中動(dòng)物體內(nèi)合成代謝明顯低于分解代謝，致使機(jī)體蛋白質(zhì)合成不足，需要消耗大量能量來(lái)改善已失衡的內(nèi)環(huán)境，此時(shí)受到生長(zhǎng)抑制的斷奶仔豬體內(nèi)用于維持生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)將轉(zhuǎn)向于維持與免疫相關(guān)的過(guò)程[1]，使得飼料利用率降低，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，因此尋找出緩解斷奶仔豬免疫應(yīng)激的有效措施至關(guān)重要?，F(xiàn)階段，在飼料中添加化學(xué)合成藥物和抗生素等飼料添加劑雖可以有效預(yù)防疾病、緩解免疫應(yīng)激，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，但因抗生素濫用而引發(fā)的細(xì)菌耐藥性以及藥物殘留問(wèn)題不容忽視。世界衛(wèi)生組織在2017年11月7日建議農(nóng)民和食品企業(yè)不應(yīng)再對(duì)健康動(dòng)物例行使用抗生素，國(guó)際上開(kāi)始掀起對(duì)天然藥物研究的熱潮。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉復(fù)方制劑通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子生成，正向調(diào)節(jié)由環(huán)磷酰胺（CY）介導(dǎo)的小鼠的細(xì)胞免疫，能有效拮抗CY對(duì)肝脾組織造成的損傷，并且效果優(yōu)于經(jīng)典方劑-四君子湯[2]，銀杏葉對(duì)于脾虛性腹瀉斷奶仔豬腸道黏膜及肝脾組織的損傷有一定的修復(fù)和維持作用[3]，但是否能緩解由免疫應(yīng)激造成的斷奶仔豬生長(zhǎng)抑制及其對(duì)免疫功能的影響需要進(jìn)一步研究。因此，本試驗(yàn)中選用大腸桿菌脂多糖（LPS）刺激斷奶仔豬以期建立免疫應(yīng)激模型，探討銀杏葉復(fù)方制劑對(duì)斷奶仔豬的小腸黏膜形態(tài)及其上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（IEL）和杯狀細(xì)胞（GC）數(shù)量的影響，旨在為探討銀杏葉復(fù)方是否對(duì)免疫應(yīng)激斷奶仔豬產(chǎn)生調(diào)控作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 銀杏葉復(fù)方制劑的制備 銀杏葉復(fù)方制劑由銀杏葉、陳皮、砂仁、黨參、黃芪、白術(shù)、茯苓等按一定比例組成。采用傳統(tǒng)水煎法制備，蒸餾水預(yù)先浸泡2 h，達(dá)到第1次沸騰時(shí)保持微沸30 min，濾出藥液；藥渣加溫水再次煮沸后，仍保持微沸30 min，濾出藥液，合并2次藥液，利用沸騰水浴將藥液濃度濃縮成每毫升含1g生藥（按照生藥量計(jì)算），-20 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)藥品 LPS：大腸桿菌血清型 O55:B5，Sigma公司。

1.3 斷奶仔豬免疫應(yīng)激模型的建立 試驗(yàn)選取平均體重為（9.52±0.80）kg（35±1）日齡的杜 × 長(zhǎng) × 大雜交斷奶仔豬36頭，按體重、胎次等處理原則隨機(jī)分為3個(gè)處理，每個(gè)處理分為4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭。3個(gè)處理組均飼喂基礎(chǔ)日糧，其中，銀杏葉復(fù)方組每頭每天灌服110 mL銀杏葉復(fù)方制劑，LPS應(yīng)激組每頭每天灌服110 mL生理鹽水，對(duì)照組每頭每天灌服110 mL生理鹽水，預(yù)試期7 d，正試期27 d。在正式試驗(yàn)第23天對(duì)LPS應(yīng)激組和銀杏葉復(fù)方組進(jìn)行腹膜注射LPS，注射劑量為100 μg/kg，對(duì)照組腹膜注射等量的生理鹽水。

1.4 樣品的采集及指標(biāo)測(cè)定 正試期結(jié)束后，對(duì)所有試驗(yàn)豬進(jìn)行屠宰取樣。從仔豬十二指腸、空腸及回腸中段切取約1cm2的組織樣，用0.9%生理鹽水沖洗凈腸道內(nèi)容物，放入10%的福爾馬林中固定，制成切片觀察。

1.4.1 各腸段黏膜形態(tài)的測(cè)定 在光鏡下分別觀察比較各試驗(yàn)組中3段小腸的腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，選取視野中6根較長(zhǎng)且走向平直的腸絨毛運(yùn)用Motic Images Plus 2.0照相處理軟件測(cè)量其長(zhǎng)度，選取各樣本中最為完整的隱窩測(cè)量其深度，并計(jì)算腸絨毛高度/隱窩深度（V/C）。絨毛頂端至腸腺開(kāi)口的垂直高度為腸絨毛高度，腸腺開(kāi)口處至黏膜肌層的垂直高度為隱窩深度[4]。

1.4.2 各腸段上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及杯狀細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定光鏡下詳細(xì)觀察各腸段中腸絨毛的形態(tài)特點(diǎn)及其IEL和GC的總體分布情況。計(jì)數(shù)方法：每張切片觀察5個(gè)視野，從中選擇6根走向平直且排列整齊的腸絨毛，計(jì)數(shù)每100個(gè)小腸黏膜上皮細(xì)胞中含有的IEL及GC數(shù)量，IEL計(jì)數(shù)表示為每100個(gè)上皮細(xì)胞對(duì)應(yīng)的IEL數(shù)量；以高碘酸－希夫（PAS）對(duì)GC進(jìn)行染色，GC計(jì)數(shù)表示為每100個(gè)上皮細(xì)胞對(duì)應(yīng)的GC數(shù)量[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，均值的多重比較采用Duncan's進(jìn)行，結(jié)果以用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 銀杏葉復(fù)方對(duì)LPS應(yīng)激斷奶仔豬腸道黏膜形態(tài)的影響 由表1可知，銀杏葉復(fù)方組與對(duì)照組的十二指腸、空腸絨毛高度較LPS應(yīng)激組顯著提高（P＜0.05），銀杏葉復(fù)方組回腸絨毛高度顯著高于LPS應(yīng)激組和對(duì)照組（P＜0.05）；銀杏葉復(fù)方組十二指腸、空腸隱窩深度顯著低于LPS應(yīng)激組和對(duì)照組（P＜ 0.05）；與對(duì)照組及LPS應(yīng)激組相比，銀杏葉復(fù)方顯著提高了其十二指腸、空腸及回腸段的V/C（P＜0.05）。各組腸黏膜形態(tài)光鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖1，銀杏葉復(fù)方組十二指腸絨毛排列有規(guī)則，且與其余2組相比其長(zhǎng)度相對(duì)較長(zhǎng)，LPS應(yīng)激組腸絨毛上皮內(nèi)細(xì)胞少數(shù)變性壞死脫落；LPS應(yīng)激組空腸絨毛相對(duì)其余2組較為低矮，結(jié)構(gòu)不清晰，腸絨毛末端上皮細(xì)胞脫落，對(duì)照組空腸絨毛緊密排列，與LPS應(yīng)激組相比起腸絨毛結(jié)構(gòu)較為完整，銀杏葉復(fù)方組腸絨毛排列緊密且有規(guī)則且腸絨毛結(jié)構(gòu)較為完整，隱窩較淺；銀杏葉復(fù)方組回腸無(wú)絨毛脫落，排列整齊有規(guī)則且其絨毛長(zhǎng)度高于對(duì)照組及LPS應(yīng)激組，固有層、黏膜下層、肌層未見(jiàn)明顯病理變化，LPS應(yīng)激組絨毛末端存在少數(shù)上皮細(xì)胞變性脫落現(xiàn)象且絨毛周邊不完整，排列稀疏，對(duì)照組回腸絨毛排列規(guī)則且結(jié)構(gòu)較為完整。IEL多分布于上皮細(xì)胞基底膜附近，胞核深染，胞質(zhì)少；LPS應(yīng)激組空腸段腸絨毛固有層及腔面內(nèi)中有少量游離的IEL；在LPS應(yīng)激條件下，LPS應(yīng)激組的小腸IEL數(shù)量明顯減少，而銀杏葉復(fù)方組的小腸IEL顯著增多。GC散在于腸黏膜上皮層柱狀細(xì)胞之間，呈散在的淡色空泡狀；在免疫應(yīng)激條件下，LPS應(yīng)激組的小腸GC顯著減少，銀杏葉復(fù)方組腸上皮細(xì)胞呈單層整列且排列緊密，GC輪廓清晰。

表1 銀杏葉復(fù)方對(duì)斷奶仔豬小腸黏膜形態(tài)的影響（n=12）

圖1 各組腸道光鏡圖（HE，×40）

圖2 各組腸道細(xì)胞光鏡圖（×400）

2.2 銀杏葉復(fù)方對(duì)LPS應(yīng)激斷奶仔豬小腸IEL及GC數(shù)量的影響 由表2可知，銀杏葉復(fù)方組小腸各段IEL和GC數(shù)量均顯著高于LPS應(yīng)激組（P＜0.05），十二指腸、空腸的IEL數(shù)量與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），但回腸IEL數(shù)量較對(duì)照組顯著提高（P＜0.05）；銀杏葉復(fù)方組十二指腸、空腸的GC數(shù)量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但回腸GC數(shù)量與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

由圖2可看出，對(duì)照組的十二指腸腸絨毛表面為單層柱狀上皮，在腸黏膜上皮細(xì)胞中，GC靠近細(xì)胞基底膜，呈高柱狀，胞核為橢圓形，輪廓清晰，呈單層排列；

3 討 論

3.1 斷奶仔豬免疫應(yīng)激模型的建立 LPS屬于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的最外層結(jié)構(gòu)，在生理及病理?xiàng)l件下通過(guò)胃腸道進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，可使機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，致使機(jī)體發(fā)熱，出現(xiàn)采食量下降以及生產(chǎn)性能降低等現(xiàn)象?，F(xiàn)代動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)免疫學(xué)中常利用LPS建造斷奶仔豬免疫應(yīng)激模型[6]。本試驗(yàn)中，LPS誘導(dǎo)斷奶仔豬產(chǎn)生了一系列細(xì)菌感染癥狀，表現(xiàn)為厭食、發(fā)熱、嘔吐腹瀉，這與上述文獻(xiàn)的結(jié)果一致，說(shuō)明免疫應(yīng)激模型建立成功。本試驗(yàn)旨在觀察銀杏葉復(fù)方對(duì)LPS應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜形態(tài)的修復(fù)作用，故在LPS刺激后4 d采樣[7]。

表2 銀杏葉復(fù)方對(duì)斷奶仔豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響（n=12）

3.2 銀杏葉復(fù)方對(duì)免疫應(yīng)激模型斷奶仔豬腸黏膜形態(tài)的影響 小腸是動(dòng)物體消化道中主要吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的器官，斷奶仔豬受到免疫應(yīng)激引起小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如腸絨毛萎縮、隱窩深度增加、腸道功能的完整性受到破壞，致使其消化吸收功能發(fā)生改變[8]。本試驗(yàn)中以V/C衡量小腸消化吸收功能狀態(tài)，若比值升高則表示動(dòng)物體腸道黏膜及其消化吸收功能有所改善。同時(shí)，隱窩深度還反映其腸道上皮細(xì)胞的生成率[9]。李焰等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶肉兔的日糧中添加適量銀杏葉復(fù)方能夠?qū)π∧c黏膜組織起修復(fù)和維持作用。本試驗(yàn)中，銀杏葉復(fù)方組顯著提高了應(yīng)激型斷奶仔豬小腸段腸絨毛高度以及V/C，除此之外，LPS應(yīng)激組的十二指腸以及空腸隱窩深度顯著高于銀杏葉復(fù)方組，表明銀杏葉復(fù)方對(duì)受損腸道黏膜結(jié)構(gòu)起一定的修復(fù)作用。

3.3 銀杏葉復(fù)方對(duì)免疫應(yīng)激模型斷奶仔豬腸道內(nèi)IEL與GC數(shù)量的影響 高玉云等[11]報(bào)道，腸道細(xì)胞的高速增殖、細(xì)胞凋亡、上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的更新與斷奶仔豬腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率和新陳代謝直接相關(guān)。腸道黏膜上皮細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別分子（PRRS）識(shí)別病原及其分泌的毒素產(chǎn)生先天性免疫應(yīng)答，是機(jī)體天然的機(jī)械屏障[12]，腸上皮細(xì)胞以緊密連接為主，GC分泌的黏液組成動(dòng)物體與外界的一層屏障，是動(dòng)物機(jī)體阻止病原菌入侵的第一道防線[13]。斷奶仔豬受到免疫應(yīng)激后，由于腸上皮細(xì)胞構(gòu)成的天然屏障受到破壞，因此修復(fù)腸道上皮細(xì)胞成為至關(guān)重要的因素之一。石辛普[14]提出，腸上皮細(xì)胞的修復(fù)與更新離不開(kāi)與其密切相關(guān)的IEL，動(dòng)物體在受到抗原和病原微生物入侵時(shí)，小腸IEL是機(jī)體免疫系統(tǒng)中最先與其斗爭(zhēng)的免疫細(xì)胞[15]；石玉祥等[16]研究表明，IEL數(shù)量不僅可以提示小腸免疫防御功能的完善程度以及局部黏膜免疫屏障的完整性，還能通過(guò)調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子的方式調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和其他淋巴細(xì)胞功能。GC通過(guò)分泌黏液而附著在小腸黏膜的表面，起保護(hù)腸黏膜作用，GC還能阻止上皮細(xì)胞與毒素直接接觸，通過(guò)黏膜表面分泌黏液在機(jī)體局部執(zhí)行特異性或者非特異性免疫功能[17]。小腸的腸黏膜形態(tài)和小腸上皮細(xì)胞特定結(jié)構(gòu)共同作用形成機(jī)體抗感染的重要防線。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉復(fù)方組脾虛性斷奶仔豬十二指腸杯狀細(xì)胞數(shù)、空腸和回腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著高于模型組[3]。本試驗(yàn)中，LPS應(yīng)激組中的小腸IEL以及GC數(shù)量較對(duì)照組及銀杏葉復(fù)方組顯著減少，表明銀杏葉復(fù)方可修復(fù)免疫應(yīng)激型斷奶仔豬受損的腸道黏膜屏障。

4 結(jié) 論

綜上所述，銀杏葉復(fù)方可緩解LPS造成的免疫應(yīng)激，且能維持并修復(fù)斷奶仔豬腸黏膜形態(tài)，從而改善機(jī)體腸道的消化吸收功能，提高生產(chǎn)性能。