一個中國北方漢族不寧腿綜合征家系的基因?qū)W篩查研究

薛云 申珅 劉雅萍 崔藝濃 杜藝彤 肖玉蓮 脫厚珍

不寧腿綜合征(restless legs syndrome，RLS)是常見的神經(jīng)系統(tǒng)感覺運動障礙性疾病，其主要表現(xiàn)為難以名狀的腿部不適感，如酸脹、針刺等，并迫使患者產(chǎn)生活動下肢的沖動，癥狀在休息或夜間時發(fā)生或加重，活動后上述癥狀可減輕。既往對RLS的遺傳學研究發(fā)現(xiàn)了多個與不安腿相關(guān)的遺傳位點。全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)MAOA、MEIS1、BTBD9、MAP2K5/LBXCOR1、PTPRD、NOS1基因可能增加RLS患病風險[1]。國內(nèi)相關(guān)研究較少，可能與家系人員分散，樣本獲取困難等有關(guān)。本研究通過對一個患病人數(shù)多，患病程度重的RLS家系進行MassARRAY質(zhì)譜法檢測單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點，從而推測與該家系發(fā)病可能有關(guān)的基因及SNPs，進一步探究國內(nèi)RLS家系遺傳特點。

1 材料和方法

1.1觀察對象選取首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診就診的RLS患者，從中篩選出家族人數(shù)較多、遺傳方式明確的家系。獲得知情同意后，由2位神經(jīng)科醫(yī)師收集該家系先證者及患病成員的臨床資料，包括病史、體格檢查等。RLS診斷標準依據(jù)2014年國際不安腿綜合征協(xié)作組頒布的診斷指南[2]。并以IRLS-RS量表(International RLS Rating Scale，IRLS-RS)對RLS癥狀的嚴重程度評分，從而進行嚴重程度分級。

1.2采集血樣對家系中患者及其親屬成員每人抽取外周靜脈血4 mL，EDTA抗凝管保存，共收集有效血樣12份提取DNA，均DNA濃度≥5 ng/μL，-20°C保存?zhèn)浜罄m(xù)實驗，其中Ⅱ1、Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ6、Ⅲ7、Ⅲ9、Ⅲ10均未提供血樣。

1.3MassARRAYSNP檢測

1.3.1SNP選擇及引物設(shè)計：通過總結(jié)文獻，選擇了國內(nèi)外已報道與RLS發(fā)病相關(guān)的SNP位點，共涉及8個基因20個SNP位點[3]。采用 Agena 公司在線引物設(shè)計軟件 Assay Design Suite v2(https：//seqpws1.agenacx.com/AssayDesignerSuite.html)在線設(shè)計引物，基因及SNP位置及引物序列見表1。

1.3.2多重PCR擴增反應：在同一PCR反應體系里加上2對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應。反應池包含多個SNP位點的正向和反向PCR擴增引物mix、PCR緩沖液、DNA模板、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、MgCl2等。反應條件：95℃ 120 s；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，循環(huán)45次；72℃ 5 min，4℃保存。

1.3.3堿性磷酸酶化處理：用堿性磷酸酶降解PCR反應未消耗完的三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs)。1個反應體系池中包括堿性磷酸酶、堿性磷酸酶緩沖液等。反應條件：37℃ 40 min；85℃ 5 min，4℃保存。

1.3.4SNP位點特異性單堿基延伸反應：多重SNP位點特異性引物延伸反應，即在PCR擴增后的產(chǎn)物中，加入SNP序列特異延伸引物，在SNP 位點上，延伸1個堿基，并進行脫鹽處理。

1.3.5點樣及分析數(shù)據(jù)：擴增產(chǎn)物經(jīng)樹脂除鹽純化后，點樣到覆蓋有基質(zhì)的SpectroCHIP芯片陣列中進行質(zhì)譜檢測。采用MassARRAYTyper軟件解讀質(zhì)譜檢測的分子量峰，轉(zhuǎn)化顯示為SNP 位點所對應的分子量質(zhì)譜峰圖，從而明確位點單核苷酸基因分型結(jié)果。

1.4單體型分析單體型是指位于一條染色體特定區(qū)域的一組相互關(guān)聯(lián)，并傾向于以整體遺傳給后代的單核苷酸多態(tài)的組合，又稱單倍體型或單元型?；赟NPs基因分型結(jié)果及家系圖，選擇直系家系成員基因分型完整的家庭成員進行分析，完善家系圖并分析可能存在的相關(guān)致病基因。

2 結(jié)果

2.1家系情況入組家系現(xiàn)存3代，根據(jù)不寧腿綜合征診斷標準(2014)，明確的RLS患病者9人，其中男性患者3人，女性患者6人；嚴重程度為重度患者2人(29分)，嚴重程度為中度患者2人(18分及19分)，嚴重程度為輕度5人。先證者(Ⅱ3，圖1)女性，75歲，漢族，約60年前開始出現(xiàn)雙下肢難以名狀的不適感，安靜狀態(tài)下出現(xiàn)，不能靜坐學習，按摩或走動后不適感減輕，平臥時癥狀加重，予其左旋多巴胺制劑及多巴胺受體激動劑治療后，癥狀好轉(zhuǎn)；無貧血、慢性腎病或多發(fā)性硬化等病史。神經(jīng)系統(tǒng)檢查未見明顯異常。

表1 已知基因SNP位點及引物序列

2.2臨床表型及遺傳方式分析該家系發(fā)病年齡相差較大，從4歲(患者Ⅳ1開始出現(xiàn)周期性肢動，可能與父母關(guān)注密切相關(guān))至38歲(患者Ⅲ6開始出現(xiàn)下肢不適感)。其中Ⅱ3及Ⅱ4患者為重度，Ⅱ3、Ⅱ4所在家庭，連續(xù)3代均有發(fā)病，其中男性3人，女性5人，符合常染色體顯性遺傳模式；但Ⅱ6號所在家庭，父母表型正常，女兒為發(fā)病表型，考慮Ⅱ6號成員為不外顯表型。

2.3MassARRAYSNP檢測分析該家系RLS患者未攜帶rs9394492-C 等位基因及rs1052553-G等位基因。該家系攜帶rs12469063-G等位基因、rs2300478-G等位基因、rs6710341-G等位基因、rs3923809-G等位基因、rs4714156-G等位基因、rs9357271-T等位基因、rs9296249-C等位基因、rs1026732-A等位基因、rs11635424-G等位基因、rs12593813-G等位基因、rs3784709-T等位基因、rs4489954-T等位基因、 rs6494696-C等位基因、rs884202-G等位基因、rs1975197-A等位基因、rs4626664-A等位基因攜帶者均存在發(fā)病與不發(fā)病兩種表型，表示這些SNP均與該家系RLS患者無共分離，考慮與本家系發(fā)病無關(guān)。其中MAP2K5基因所檢測的rs3784709、rs4489954、rs6494696、rs884202、rs1975197位點與患者基因型均一致，而4名正常人中出現(xiàn)兩種不同基因型，但考慮兩名攜帶與患者相同基因型的正常成員年齡較小(15歲及39歲)，不能除外年齡原因未發(fā)病可能。具體見表2。

注：：正常男性；：正常女性；：男性患者；：女性患者；：先證者；：死亡者 圖1 RLS家系圖譜

表2 RLS家系中接受基因檢測者的臨床表現(xiàn)及部分基因位點檢測情況

注：—：未檢出

2.4單體型分析基于SNPs基因分型結(jié)果及家系圖，Ⅱ2號、Ⅱ3號、Ⅲ1號、Ⅲ2號及Ⅳ1號家庭成員位點基因分型完整，利用此家庭做單體型分析，分析包含多個SNP位點的基因。

2.4.1MEIS1基因：該基因3個SNPs分布如圖2所示，該家庭所有RLS患者可能均攜帶Ⅱ3號個體ATA染色體(黃條)，這提示MEIS1基因可能與該家系發(fā)病有關(guān)。

注：：正常男性；：正常女性；：男性患者；：女性患者；：先證者；：死亡者 圖2 MEIS1基因RLS單體型家系圖

2.4.2BTBD9基因：該基因5個SNPs分布如圖3所示，該家庭RLS患者Ⅲ2號患者未攜帶與Ⅱ3號患者黃色GTCTT染色體，說明Ⅲ2號患者及Ⅲ3患者未攜帶來自Ⅱ3患者的相同染色體。這提示BTBD9基因可能與該家系發(fā)病無關(guān)。

注：：正常男性；：正常女性；：男性患者；：女性患者；：先證者；：死亡者 圖3 BTBD9基因RLS單體型家系圖

2.4.3MAP2K 5基因：該基因7個SNPs分布如圖4所示，該家庭所有RLS患者可能均攜帶II3號個體AAATTCG染色體(黃條)，這提示MAP2K5基因可能與該家系發(fā)病有關(guān)。

注：：正常男性；：正常女性；：男性患者；：女性患者；：先證者；：死亡者 圖4 MAP2K5基因RLS單體型家系圖

3 討論

本研究根據(jù)發(fā)病程度及發(fā)病人數(shù)進行篩選后，選擇了一個3代共9名患病者的家系，對其中的12人通過MassARRAY分子量陣列技術(shù)檢測文獻報道的可能與RLS相關(guān)的共計8個基因，20個SNPs位點，獲得該家系成員不同基因相關(guān)位點基因分型，但均未發(fā)現(xiàn)共分離現(xiàn)象。之后對一家庭成員及位點基因分型完整的Ⅱ3患者家庭單元進行單體型分析，發(fā)現(xiàn)該家庭4名RLS患者可能均攜帶相同的MEI1基因及MAP2K5基因單體型，這提示MEI1基因及MAP2K5基因可能與該家系發(fā)病有關(guān)。

RLS作為一種病因未明確的，常見的神經(jīng)系統(tǒng)感覺運動障礙性疾病，約50%的RLS患者有陽性家族史[4]。其家族聚集性的特點，使遺傳學研究有著重要的意義?；诖罅繂我患彝サ挠^察，有研究者提出不安腿綜合征家系均遵循孟德爾常染色體顯性遺傳模式[1]，而對于北美77個血統(tǒng)的分離研究提出一種與性別作為協(xié)變量的常染色體顯性遺傳模式，并且發(fā)現(xiàn)年齡可作為一個分水嶺，提出分界線為26.3歲[5]，本研究中收集的家系圖顯示Ⅱ3、Ⅱ4家庭，符合常染色體顯性遺傳模式；但Ⅱ6家庭，RLS陰性父母的女兒為RLS陽性患者，Ⅱ6成員為不外顯，在家系人員病史詢問過程中，Ⅱ6號成員及其家屬再三否認下肢酸脹疼痛或描述不清的不適感，同時，其家屬否認該成員睡眠過程中出現(xiàn)肢體抽動等不適。這可能意味著多種因素與RLS相關(guān)，如遺傳因素、環(huán)境因素等，各因素之間可能相互作用，從而影響RLS發(fā)病與否，因此仍需納入更多的RLS家系，對其遺傳方式進一步研究觀察。

既往家族連鎖分析發(fā)現(xiàn)了多個與不寧腿相關(guān)的遺傳位點，包括12q13-23(RLS1)、14q13-21(RLS2)、9p24-22(RLS3)、2q33(RLS4)、20p13(RLS5)等。全基因組SNP關(guān)聯(lián)分析是近年來逐漸發(fā)展成熟的高通量遺傳分析技術(shù)，基于此技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)MAOA、MEIS1、BTBD9、MAP2K5/LBXCOR1、PTPRD、NOS1等基因可能增加RLS患病風險[1]。亞洲地區(qū)關(guān)于RLS的研究相對較少，數(shù)量有限的來自韓國、國內(nèi)的研究也發(fā)現(xiàn)亞洲RLS患者與BTBD9、MEIS1、MAP2K5及PTPRD相關(guān)[6-9]，但均未針對原發(fā)性RLS家系進行研究，尚未發(fā)現(xiàn)不同基因與特定的臨床表現(xiàn)之間的關(guān)聯(lián)。MEIS1屬于Meis同源框家族成員之一，其活動與鐵代謝相關(guān)，對于神經(jīng)嵴的發(fā)育有重要作用，在腦組織表達廣泛[10]。MAP2K5編碼有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase)，與細胞增殖及肌細胞分化有關(guān)。MAP2K5所在的ERKs信號通路在保護多巴胺能神經(jīng)元上有重要作用[11]。

本研究家系來自國內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEI1、MAP2K5基因可能與該RLS家系發(fā)病有關(guān)，這一結(jié)果與國內(nèi)外既往RLS相關(guān)遺傳學研究基本一致。但已檢測的SNPs均未發(fā)現(xiàn)共分離現(xiàn)象，這提示這些基因上可能存在其他位點影響這一疾病的發(fā)生，未來尚需要進一步研究來探索，也可能亞洲RLS家系存在某些特定的遺傳位點，更多國內(nèi)RLS的研究有助于探索亞洲RLS家系的遺傳異質(zhì)性，擴展RLS基因庫，從而進一步揭示RLS的發(fā)病機制。本研究未發(fā)現(xiàn)BTBD9、PTPRD等基因與該家系RLS發(fā)病相關(guān)，其可能原因為本研究僅基于一個單一家系，不同家系可能存在不同致病相關(guān)位點可能，未來需要更多基于RLS家系的研究來證實這一點。此外，本研究選取20個已知的可能和RLS相關(guān)的SNPs位點進行檢測，隨著未來更多位點的發(fā)現(xiàn)，基因篩查的陽性率可能會提高。