RECQL4基因在肺癌組織中表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

張潔 張培先 鄧?yán)?王以

昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院（昆明 650051）

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一［1］。盡管近年來(lái)，手術(shù)、化療等治療的技術(shù)手段日益完善，但仍有超過(guò)60%的肺癌患者是在腫瘤的晚期才被發(fā)現(xiàn)［2］。近年來(lái)我國(guó)在肺癌診斷和輔助治療方面也取得了很大進(jìn)展，但由于環(huán)境和經(jīng)濟(jì)發(fā)展等眾多因素的作用，肺癌發(fā)病率仍呈逐年上升趨勢(shì)，且患者的預(yù)后情況非常差，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量［3］。因此，臨床上進(jìn)一步探索新的、有價(jià)值的診斷及預(yù)后標(biāo)志物，對(duì)進(jìn)一步提高我國(guó)肺癌的診治和評(píng)估能力具有重要意義。

RECQL4是一種ATP依賴的解旋酶，屬于RECQ家族一員。研究發(fā)現(xiàn)RECQL4的突變能夠?qū)е律窠?jīng)退行性疾病Rothmund?Thomson綜合癥［4-6］，其主要的功能是參與DNA的復(fù)制和雙鏈斷裂的修復(fù)［7-8］。眾所周知，腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)之一就是高頻率的細(xì)胞復(fù)制，有文獻(xiàn)報(bào)道DNA復(fù)制和修復(fù)酶參與了腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和化療耐藥，提示該類分子在腫瘤的發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用［9-12］。然而，目前RECQL4基因在腫瘤中作用和機(jī)制研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用組織芯片結(jié)合免疫組織化學(xué)的方法和關(guān)聯(lián)分析，研究了97例肺癌患者RECQL4表達(dá)與病理資料及臨床預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

RECQL4 Forward RECQL4 Reverse β?actin Forward β?actin Reverse 5′?AGTGACGACCAGAGCCAGAC?3′5′?CCTTAGCCCACACCATGAAA?3′5′?CCACGAAACTACCTTCAACTCC?3′5′?GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT?3′

1.1材料本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象是肺癌的手術(shù)標(biāo)本，10例正常組織、30例肺癌以及97例帶有臨床特征資料的肺癌組織樣本均來(lái)自我院腫瘤科，其中97例帶有臨床特征資料的肺癌患者于2002年1月至2009年3月接受手術(shù)治療的部分肺癌患者。本研究是由我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，招募患者均簽署了知情同意書(shū)。

本研究中應(yīng)用的肺癌細(xì)胞株A549和LTEP從中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)進(jìn)行購(gòu)買，細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清（Giboco）的RPMI 1640（Hyclone）和F12K（Invitrogen）培養(yǎng)基，于5%CO2和溫度為37 ℃的細(xì)胞孵育箱。

1.2方法

1.2.1RT?PCR與RT?qPCR采用液氮研磨和經(jīng)典Trizol法提取凍存組織的總RNA，測(cè)定OD260/OD280值，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后儲(chǔ)存在-20℃冰箱待用。RT?PCR產(chǎn)物使用2.5%的瓊脂糖膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，RT?qPCR使用伯樂(lè)道德CFX型號(hào)熒光定量?jī)x器測(cè)定，結(jié)果分析使用2?ΔΔCT法計(jì)算。RECQL4和β?actin基因的引物如下：

1.2.2免疫組化RECQL4抗體購(gòu)買于Abcam公司（ab155402）。免疫組化操作參考已發(fā)表論文［13］。一抗按1∶150稀釋，免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性率的乘積進(jìn)行表達(dá)水平定量：染色陽(yáng)性率≤5%記為0分，5%到25%記為1分，26%到50%記為2分，51%到75%記為3分，＞76%記為4分；染色強(qiáng)度分為陰性為0分，弱陽(yáng)性為1分，中陽(yáng)性為2分，強(qiáng)陽(yáng)性為3分。根據(jù)平均表達(dá)值，0～7分的患者判定為低表達(dá)組，8～12分的患者判定為高表達(dá)組。

1.2.3公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析大樣本表達(dá)驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析使用 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（www.genome?cancer.ucsc.edu/proj/site/hgHeatmap/TCGA Lung cancer（LUNG）gene expression by RNAseq（IlluminaHiSeq）·N=1124）。生存期分析使用KM plotter（http：//km?plot.com/analysis）在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。分析采用自動(dòng)選擇最佳劃界值（cutoff）；RECQL4探針為213520_at。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。當(dāng)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法有：（1）t檢驗(yàn)；（2）χ2檢驗(yàn)；（3）Kaplan?meier生存曲線。

2 結(jié)果

2.1RECQL4基因在肺癌組織中的表達(dá)情況RT?PCR結(jié)果顯示，肺癌組織中RECQL4的表達(dá)高于正常肺組織的表達(dá)水平（圖1A）。RT?qPCR結(jié)果表明，RECQL4在肺癌組織中的表達(dá)（2.891±0.081 1）也顯著高于正常肺組織（1.431±0.210 3，P＜0.001）（圖1B）。筆者使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，上述結(jié)果在大樣本肺癌病人中得到了驗(yàn)證（圖1C）。進(jìn)一步采用免疫組化方法在蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RECQL4蛋白在肺癌組織中的表達(dá)高于在癌旁組織的表達(dá)（圖2）。這些結(jié)果說(shuō)明，RECQL4基因在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于正?；虬┡越M織，提示其可能參與肺癌的發(fā)生和發(fā)展。

2.2RECQL4表達(dá)與肺癌患者臨床參數(shù)關(guān)系分析為了研究RECQL4表達(dá)與肺癌患者臨床參數(shù)的關(guān)系，本研究通過(guò)免疫組化分析了含有97例肺癌患者的組織芯片中RECQL4的表達(dá)。通過(guò)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性率進(jìn)行定量RECQL4表達(dá)后，與肺癌患者性別、年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，RECQL4表達(dá)與肺癌患者的臨床分期（P=0.011），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.026）和腫瘤大?。≒=0.037）顯著相關(guān)，而與患者的年齡（P=0.429）和性別（P=0.279）不相關(guān)（表1）。

2.3RECQL4表達(dá)與肺癌患者預(yù)后關(guān)系分析為探究RECQL4表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系，筆者使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)KM plotter分析了RECQL4表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示對(duì)于肺癌患者總生存期，RECQL4高表達(dá)是一個(gè)不良的預(yù)后指標(biāo)（P＜0.001，n=1145，圖3A）。為了分析RECQL4表達(dá)在肺腺癌和肺鱗癌患者預(yù)后中的意義是否存在差別，我們使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)KM plotter將肺腺癌和肺鱗癌分開(kāi)后分別進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RECQL4表達(dá)在肺腺癌患者總生存期（P＜0.001，n=673）中是一個(gè)不利因素（圖3B）。而在肺鱗癌中REC?QL4表達(dá)對(duì)患者總生存期并沒(méi)有影響（P=0.24，n=271，圖3C）。提示RECQL4表達(dá)在肺腺癌是一個(gè)不利預(yù)后因素。

圖1 RECQL4基因在肺癌（T）和正常組織（N）中mRNA水平表達(dá)Fig.1 The mRNA expression status of RECQL4 in Lung cancer（T）and normal tissues（N）

圖2 通過(guò)免疫組化分析RECQL4蛋白在肺癌和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)Fig.2 The expression of RECQL4 gene in lung cancer and adjacent tumor tissues detected by IHC

2.4 RECQL4基因在肺癌中功能的初步研究為了確定RECQL4基因在肺癌中是否具有功能，本研究在肺癌細(xì)胞株中對(duì)該基因表達(dá)進(jìn)行干擾（轉(zhuǎn)染用siRNA購(gòu)自Santa Cruz公司，sc?38219），通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾RECQL4基因表達(dá)后對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾RECQL4基因表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖受到了明顯的抑制作用（圖4A～C）。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RECQL4基因具有顯著的腫瘤生長(zhǎng)促進(jìn)功能，是一個(gè)潛在的癌基因。

表1 在97例肺腺癌組織中RECQL4表達(dá)與病人臨床特征之間的關(guān)系Tab.1 The relationship between RECQL4 expression and clinical characteristics in 97 adenocarcinoma patients 例

圖3 RECQL4基因表達(dá)與肺癌病人總生存期之間的關(guān)系Fig.3 The relationship between RECQL4 expression and Overall Survival（OS）of Lung cancer patients.

圖4 通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)分析RECQL4基因?qū)549和LTEP腫瘤細(xì)胞增殖的影響Fig.4 MTS assay was used to examine the effect of RECQL4 on proliferation of A549 and LTEP cells

3 討論

在腫瘤細(xì)胞中DNA高頻的復(fù)制需要大量參與復(fù)制的酶，同時(shí)復(fù)制產(chǎn)生的錯(cuò)配也需要大量修復(fù)酶進(jìn)行及時(shí)修復(fù)［14-15］。RECQL4作為一種ATP依賴的解旋酶主要參與了DNA的復(fù)制和雙鏈斷裂的修復(fù)［7-8］，這意味著RECQL4在腫瘤形成過(guò)程中可能具有非常重要的作用。我們的研究結(jié)果顯示，相對(duì)于正?；虬┡苑谓M織RECQL4在肺癌組織中的表達(dá)明顯升高，提示RECQL4在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能具有極其重要的功能。

為探究RECQL4對(duì)肺癌患者的臨床意義，我們分析了97例肺癌患者RECQL4表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RECQL4表達(dá)與肺癌患者的臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小顯著相關(guān)。RECQL4在臨床晚期（Ⅲ+Ⅳ，46.51%，20/43）中的高表達(dá)比例明顯高于在臨床早期（Ⅰ+Ⅱ，22.22%，12/54）中的高表達(dá)比例，而且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為陽(yáng)性和腫瘤越大時(shí)RECQL4高表達(dá)比例越高（表1）。這些結(jié)果預(yù)示RECQL4在肺癌中很可能是一個(gè)癌基因，且可能與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。進(jìn)一步進(jìn)行初步功能分析發(fā)現(xiàn)，RECQL4基因能夠顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。下一步我們將對(duì)RECQL4基因是否影響腫瘤的轉(zhuǎn)移進(jìn)行功能性研究。

細(xì)胞的增殖能力主要取決于兩個(gè)主要事件：細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。本研究中發(fā)現(xiàn)RECQL4能夠明顯加速腫瘤細(xì)胞的增殖，那就意味著腫瘤細(xì)胞凋亡的減少或細(xì)胞周期的加快，抑或兩者兼有。RECQL4是一個(gè)DNA螺旋酶，主要影響基因組的穩(wěn)定性和完整性，參與DNA的復(fù)制和雙鏈斷裂。綜合以上，RECQL4影響腫瘤細(xì)胞增殖很可能與存在DNA復(fù)制及斷裂的細(xì)胞周期相關(guān)。因此，我們的下一步研究的焦點(diǎn)是確定RECQL4加速腫瘤細(xì)胞增殖的主要原因（主要影響細(xì)胞周期還是細(xì)胞凋亡），以及可能的下游分子和信號(hào)級(jí)聯(lián)通路。

通過(guò)進(jìn)一步分析RECQL4表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，RECQL4低表達(dá)的患者預(yù)后情況顯著優(yōu)于高表達(dá)患者。這一結(jié)果暗示，RECQL4可以作為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)病人預(yù)后的一個(gè)潛在標(biāo)記物。為了確定RECQL4的預(yù)后意義在肺癌的兩個(gè)主要類型即肺腺癌和肺鱗癌患者中是否存在不同，我們通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)將肺腺癌和肺鱗癌患者分開(kāi)分別進(jìn)行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，RECQL4表達(dá)與肺腺癌患者的預(yù)后關(guān)系密切，而與肺鱗癌患者預(yù)后不相關(guān)。前期已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，SOX30在肺腺癌和肺鱗癌中預(yù)后意義存在不同，而且這種不同是由于該基因在兩類肺癌類型中的功能存在明顯差異［16］。那么，RECQL4表達(dá)在肺腺癌和肺鱗癌中的不同預(yù)后意義是否也存在功能上的不同目前還不得而知，還需要以后進(jìn)一步的深入研究。

本研究的創(chuàng)新之處是在肺癌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的特異性預(yù)后評(píng)估指標(biāo)和功能基因，該結(jié)果對(duì)肺癌尤其是肺腺癌患者的準(zhǔn)確預(yù)后評(píng)估具有重要的指導(dǎo)意義，并為進(jìn)一步明確肺癌的發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

本研究的不足之處在于肺癌樣本量不足，以至于缺少肺鱗癌患者中RECQL4表達(dá)與臨床特征資料之間的關(guān)系分析。我們下一步將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并增加除肺腺癌和肺鱗癌外的其他肺癌類型患者如小細(xì)胞肺癌等的樣本，探究RECQL4表達(dá)在其他類型肺癌患者中的臨床和預(yù)后意義，并分析不同類型肺癌患者中RECQL4臨床和預(yù)后意義是否存在不同。進(jìn)一步探索RECQL4基因在不同類型肺癌中是否存在功能及具體分子機(jī)制的不同。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在肺癌中REC?QL4的表達(dá)顯著高于正?；虬┡越M織，且其表達(dá)與患者的臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小有關(guān)密切。初步功能分析發(fā)現(xiàn)，RECQL4基因能夠明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，是一個(gè)重要候選癌基因。預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，RECQL4低表達(dá)肺腺癌患者預(yù)后顯著優(yōu)于高表達(dá)肺腺癌患者，顯示RECQL4是一個(gè)有潛在的具臨床應(yīng)用價(jià)值的生物標(biāo)志物。而且，RECQL4表達(dá)只在肺腺癌患者總生存期中是一個(gè)不利因素，而在肺鱗癌中與患者生存沒(méi)有關(guān)系。