全反式維甲酸通過TGF?β1/SMAD4信號通路對宮腔粘連細胞模型纖維化的影響

劉麗敏 史文娟 何芳 胡海燕

深圳市婦幼保健院婦科（廣東深圳 518000）

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA），1948年由ASHERMAN［1］首次描述，因?qū)m腔手術史帶來的創(chuàng)傷、宮腔感染（結核）、放射線（子宮動脈栓塞術）等致使子宮內(nèi)膜發(fā)生纖維化，造成子宮腔和或?qū)m頸管腔出現(xiàn)部分或全部閉塞。月經(jīng)量減少、閉經(jīng)、不孕或反復性流產(chǎn)、慢性盆腔痛等是IUA常見的臨床癥狀［2］，部分患者無明顯癥狀。目前IUA的主要治療方式是宮腔鏡下宮腔粘連松解術及術后宮腔內(nèi)放置物理屏障、輔助雌激素治療［3-4］。IUA的發(fā)展與子宮內(nèi)膜基底層損傷和子宮內(nèi)膜修復障礙有關［1］，主要病理改變是炎癥及細胞外基質(zhì)纖維蛋白原的聚集，進而子宮內(nèi)膜纖維化［5］。轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF?β）信號被認為是負責細胞外基質(zhì)合成的最有效的促纖維化途徑之一。而全反式維甲酸（all?trans retinoic acid，ATRA）是維生素A的生物活性衍生物，在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出調(diào)節(jié)細胞分化、增殖和凋亡的作用［6-7］。最近的研究［8-10］表明，ATRA在一些纖維化疾病中發(fā)揮抗纖維化作用。SONG等［9］發(fā)現(xiàn)ATRA能阻斷TGF?β信號通路，減弱博來霉素誘導大鼠肺部纖維化。目前國內(nèi)外尚無有關ATRA與人宮腔粘連疾病的相關性研究。本實驗通過TGF?β1作用原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞（human endometrial stromal cells，HESCs）使其發(fā)生纖維化，進而構建IUA細胞模型，研究ATRA在IUA細胞水平中抗纖維化的作用機制。

1 資料和方法

1.1 資料

1.1.1標本選取2016年5月至2017年5月，在深圳市婦幼保健院婦科，因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變、子宮漿膜下肌瘤及肌壁間肌瘤行子宮切除術或因不孕癥行宮腔鏡下子宮內(nèi)膜活檢術婦女的新鮮子宮內(nèi)膜8例，年齡30～45歲，經(jīng)周期規(guī)律（25～ 32 d），術前未應用激素及宮內(nèi)放置節(jié)育器3個月以上，且術后病理提示子宮內(nèi)膜無病變。本研究獲得深圳市婦幼保健院倫理審查會通過，術前征得患者同意及簽署知情同意書。

1.1.2試劑試劑胎牛血清（NTC）；Recombinant Human TGF?β1（PeproTech）；Ⅰ型膠原酶、ATRA（Sigma）；兔抗人波形蛋白（Vimentin）抗體、兔抗人角蛋白CK?18抗體（SANTA CRUZ）；兔抗人α?SMA單克隆抗體、兔抗人COL1A1多克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔IgG H&L（CST）；兔抗人 SMAD4單克隆抗體（Abcam）；TRIzol re?agent、逆轉錄試劑盒、SYBR?熒光定量試劑盒（Ta?kara）；ECL（Millipore，美國）。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的提取及培養(yǎng)。原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的提取采用0.2%濃度的Ⅰ型膠原酶消化-篩網(wǎng)過濾。眼科剪將刮宮式取出的子宮內(nèi)膜組織盡量剪碎；加入0.2%Ⅰ型膠原酶4～5 mL，置入37℃恒溫水浴鍋內(nèi)消化60 min；200～400目細胞篩網(wǎng)過濾，收集細胞懸液；1 000 r/min離心5 min，去上清，15%完全培養(yǎng)基重懸，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育；6～8 h后更換培養(yǎng)基（去除未貼壁細胞），得到純化的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞。2～3 d換液，1∶3～1∶4比例傳代及凍存。

1.2.2細胞形態(tài)學觀察及鑒定原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的形態(tài)學及鑒定。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學特征及其變化。細胞鑒定：免疫細胞化學法（immunocytochemistry，ICC）法檢測 Vimentin和CK?18的表達。方法如下：細胞種植24孔板，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次；0.5%Triton?100室溫孵育20 min，PBS洗滌3次；5%BSA室溫封閉20 min，去除封閉液；分別加入Vimentin抗體和CK?18抗體，陰性對照組PBS代替一抗，4℃冰箱濕盒內(nèi)孵育過夜；次日棄一抗，PBS洗滌3次；加入山羊抗兔二抗，37℃孵育20 min，PBS洗滌3次；辣根過氧化酶親合素SABC，37℃孵育20 min，PBS洗滌4次；DAB顯色液，避光37℃孵育5～10 min，去離子水終止染色；蘇木素來復染細胞核，37℃孵育2 min，去離子水終止染色；常規(guī)梯度75%、85%、95%、100%乙醇脫水2 min，二甲苯透明1 min，倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3誘導培養(yǎng)TGF?β1誘導HESCs建立人宮腔粘連細胞模型及ATRA處理。0、2.5、5、10和20 ng/mL TGF?β1作用于HESCs 48 h，qRT?PCR法檢測COL1A1、α?SMA mRNA表達。以10 ng/mL TGF?β1作用于HESCs 48 h，隨后0、0.1、1和10 μm/mL ATRA作用 48 h，qRT?PCR、WB檢測COL1A1、α?SMA、及SMAD4的mRNA和蛋白表達。

1.2.4蛋白表達qRT?PCR法檢測各組細胞COL1A1、α?SMA、和SMAD4的mRNA的表達。TRIzol提取RNA，紫外分光光度儀測定RNA純度及濃度，用Takara公司逆轉錄試劑盒逆轉成cDNA。引物序列：COL1A1正向引物：5′?GAGGGCCAAGAC?GAAGACATC?3′，反向引物：5′?CAGATCACGTCAT?CGCACAAC?3′；α?SMA正向引物：5′?CGGGACATC?AAGGAGAAACT?3′，反向引物：5′?CCATCAGGCA?ACTCGTAACTC?3′；SMAD4正向引物：5′?CGGAT?TACCCAAGACAGAGC?3′，反向引物：5′?AAGGTT?GTGGGTCTGCAATC?3′；GAPDH 正向引物：5′?CG?GAGTCAACGGATTTGGTCGTAT?3′，反向引物5′?A?GCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC?3′。擴增條件：首先95℃預變性30 s；95℃變性5 s→60℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)；溶解曲線95℃10 s→40℃60 s。

1.2.5Western blotWB法檢測各組細胞COL1A1、α?SMA、和SMAD4的蛋白表達。裂解液裂解細胞提取總蛋白；通過BCA?100蛋白定量法得出蛋白濃度；配制8%分離膠、5%濃縮膠進行電泳；濕轉法轉膜；5%脫脂奶粉封閉1 h；分別加入COL1A1抗體、α?SMA抗體、SMAD4抗體、GAPDH抗體，4℃過夜，1×TBST洗膜5 min×3次；HRP標記的羊抗兔二抗室溫下孵育1～2 h，1×TBST洗膜5 min×3次；條帶中加入ECL顯影液，超靈敏化學發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，并行方差齊性檢驗，采用單因素方差分析（One?Way ANOVA）比較多組間蛋白及mRNA表達水平。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1HESCs的形態(tài)學特征細胞貼壁24 h后呈短梭形散在分布；72 h后，細胞伸展呈梭形或紡錘形，局部同心圓樣或洋蔥樣形成細胞集落。3代后細胞形態(tài)穩(wěn)定，生長旺盛，纖維樣貼壁生長（圖1）。

2.2HESCs的細胞鑒定ICC法檢測間質(zhì)細胞標記物Vimentin染色陽性，呈棕褐色；上皮細胞標志物CK?18陰性；PBS組陰性；CK?18與PBS組一致，進而證實為純度較高的HESCs（圖2）。

圖1 HESCs細胞形態(tài)（100×）Fig.1 HESCsof different passages observed underan inverted fluorescence microscope（100 ×）

圖2 免疫細胞化學染色，進行細胞鑒定（100×）Fig.2 Immunocytochemical staining was performed to identify HESCs under an inverted fluorescence microscope（100 ×）

2.3 COL1A1、α?SMA mRNA在各濃度TGF?β1組的表達qRT?PCR結果顯示：0、2.5、5、10和20 ng/mL TGF?β1組COL1A1和α?SMA的mRNA表達均逐漸增加后下降，10 ng/mL TGF?β1組表達最高，差異均有統(tǒng)計學意義。后續(xù)選取10 ng/mL TGF?β1構建人宮腔粘連細胞模型（圖3）。

圖3 COLIA1、α?SMA在不同濃度TGF?β1組的表達Fig.3 Therelative mRNA expression of COLIA1、α?SMA in HESCs after the treatments of diverse concentrations of TGF?β1

2.4α?SMA、COL1A1和SMAD4在10 ng/mL TGF?β1及各濃度ATRA組處理后的表達qRT?PCR及WB結果顯示，與NC組相比，1和10 μmol/mL ATRA組COL1A1、α?SMA和 SMAD4的mRNA和蛋白表達下降，其中1 μmol/mL ATRA組下降最明顯。差異均有統(tǒng)計學意義（圖4、5）。

圖4 α?SMA、COLIA1及SMAD4 mRNA在10ng/mlTGF?β1、ATRA不同濃度作用組的表達Fig.4 Therelative mRNA expression of α?SMA，COLIA1 and SMAD4 in HESCs after the treatments of 10 ng/mL TGF?β1 and diverse concentrations of ATRA

圖5 α?SMA、COLIA1及 SMAD4 蛋白在10 ng/mL TGF?β1、ATRA不同濃度作用組的表達Fig.5 The relative proteins expressions of α?SMA，COLIA1 and SMAD4 in HESCs after the treatments of 10 ng/mL TGF?β1 and diverse concentrations of ATRA

3 討論

國內(nèi)外學者普遍認為IUA的病因與子宮受損有關，可能導致月經(jīng)異常，流產(chǎn)和不孕［3］。宮腔鏡手術已成為診斷及治療宮腔粘連的金標準技術［11］。但對于中重度IUA的手術效果和預后生殖，因子宮內(nèi)膜生長不同步而不能滿足患者要求［12］。術后宮內(nèi)放置物理屏障：宮內(nèi)節(jié)育器和Interceed防粘連膜。Interceed防粘連膜費用高，其5～7 d開始吸收，28 d左右完全吸收，且部分患者出現(xiàn)術后宮內(nèi)感染癥狀，加重了粘連的發(fā)生。宮腔粘連是世界難題，其嚴重威脅著女性的生育功能及生殖健康，進而影響家庭穩(wěn)定及社會的和諧發(fā)展。探索IUA的基因生物學機制，在IUA形成過程中應有針對性地對子宮內(nèi)膜纖維化進行治療是迫在眉睫的需求。

TGF?β1被公認為是纖維化的啟動因子。其可以激活包括SMAD［13］、MAPK途徑等多條信號傳導通路促進纖維蛋白原的異常合成增多；TGF?β1能夠促進多種細胞轉化成肌成纖維細胞（MF），包括成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞及腎小管上皮細胞等，并能誘導其表達α?SMA，而α?SMA是研究MF轉分化的標記物［14］。TGF?β1是誘導上皮-間質(zhì)轉化（EMT）并導致細胞外基質(zhì)（ECM）作為膠原蛋白過量沉積的器官纖維化的標志［15-16］。本研究中TGF?β1作用HESCs后，COL1A1、α?SMA mRNA水平高表達，證實TGF?β1能夠誘使HESCs發(fā)生纖維化改變構建IUA細胞模型，進而為研究ATRA對IUA的纖維化的作用機制提供模型支持。

SMAD家族是TGF?β信號通路中重要的細胞內(nèi)信號轉導分子。SMAD4與磷酸化的smad2/smad3結合后形成復合體，轉位至細胞核并與DNA元件結合，調(diào)控靶基因的表達［17］。在本研究中，通過TGF?β1誘導HESCs后促使SMAD4升高激活該信號通路，導致COL1A1、α?SMA高表達。全反式維甲酸（ATRA）是維生素A的生物活性衍生物，在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出調(diào)節(jié)細胞分化，增殖和凋亡的作用［6-7］。相關研究報道，ATRA可明顯抑制TGF?β/SMAD信號通路的激活［18］。本研究與其結論一致，在 IUA細胞模型中，ATRA抑制TGF?β/Smad信號通路，COL1A1、α?SMA的mRNA及蛋白水平明顯下降，改善細胞纖維化。因此，ATRA有減輕IUA的子宮內(nèi)膜再生修復中的纖維化的作用。ATRA相對成本低，改善Interceed防粘連膜費用高情況，便于臨床宮腔粘連的預防和治療的應用，有可能成為臨床預防與治療宮腔粘連的措施之一。