黨參水提物的通便作用研究

陳 亮，闞君陶，田 峰，韓 強(qiáng)，李敏杰，瞿晶菁，樊柏林，杜 軍

(1 安利(中國)研發(fā)中心有限公司，上海 201203；2 應(yīng)用毒理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079；3 湖北省疾病預(yù)防與控制研究中心，武漢 430079)

近年來研究報道，具有瀉下功能的以蒽醌和大黃素為主要活性成分的傳統(tǒng)中藥長期使用后會有安全隱患[1-5]。黨參是我國傳統(tǒng)補(bǔ)益(補(bǔ)氣)中藥，具有補(bǔ)中益氣、和脾胃、生津養(yǎng)血之功效[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黨參具有增強(qiáng)免疫力[7]、調(diào)節(jié)保護(hù)胃腸道[8]、抗?jié)僛9]、降血糖[10]以及抗炎抗氧化等[11]生物活性，但是對黨參改善便秘的作用研究較少。

本文采用地芬諾酯灌胃造成小鼠便秘模型，考察黨參水提物對便秘小鼠小腸推進(jìn)和排便的影響，同時對實(shí)驗(yàn)小鼠腸道內(nèi)五羥色胺(5-HT)和血管活性腸肽(VIP)的含量進(jìn)行測定，推測黨參輔助通便的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)環(huán)境

小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)和排便實(shí)驗(yàn)的動物為SPF級昆明種小鼠，來源于湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心，生產(chǎn)許可證號分別為SCXK(鄂)2008—0005和SCXK(鄂)2015—0018，動物使用許可證號為SYXK(鄂)2012—0065。小鼠在SPF級動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為20～26℃，濕度為40%～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑[12]

含5%的活性炭粉、10%阿拉伯膠墨汁的配制方法：準(zhǔn)確稱取阿拉伯樹膠100g，加入800mL蒸餾水，加熱煮沸至溶液呈透明狀，再稱取活性碳粉末50g加入上述溶液中，繼續(xù)煮沸3次，溶液放涼后加蒸餾水定容到1 000mL，置4℃冰箱中保存，臨用前搖勻。

黨參，藥材來源同已發(fā)表文章[12]。黨參提取物制備工藝為藥材粉碎，按料液比1∶6加入純水，95～100℃水浴加熱提取2次，每次1.5h，水提液過濾，合并，濃縮凍干，最終藥材和提取物的提取比約為2.5∶1。分別取黨參水提物16 667、8 333、4 167mg，用蒸餾水溶解并定容至100mL，供小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)和排便實(shí)驗(yàn)1～7d灌胃使用；另外，分別取黨參水提物3 333、1 667、833mg，用含5%的活性炭粉、10%阿拉伯膠墨汁溶解并定容至20mL，供小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)第8天使用。

復(fù)方地芬諾酯片，廣西河豐藥業(yè)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號為 130401。分別取復(fù)方地芬諾酯片25、50mg，研缽研碎后加入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解稀釋至100mL，分別供小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃团疟銓?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪褂?，臨用前配制。

小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)中，小鼠5羥色胺(5-HT)酶聯(lián)免疫分析試劑盒批號為201411-201505，小鼠血管活性腸肽(VIP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒批號為201412-201506；所有試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1劑量與分組 小腸推進(jìn)和排便實(shí)驗(yàn)分開但同時進(jìn)行，每個實(shí)驗(yàn)均分為陰性對照組(Negative Control，灌胃給予純水)、模型對照組(Positive Control，灌胃給予復(fù)方地芬諾酯)、黨參水提物高劑量組3 333mg/kg(High Dose)、黨參水提物中劑量組1 667mg/kg (Medium Dose)、黨參水提物低劑量組833mg/kg(Low Dose)，每組動物數(shù)量12只。每組實(shí)驗(yàn)小鼠均按0.20mL/10g BW的容量灌胃給予對應(yīng)試劑，連續(xù)灌胃7d后開始小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)或排便功能實(shí)驗(yàn)。

1.3.2小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn) 按照1.3.1分組，不同組小鼠連續(xù)灌胃7d給予不同試劑，禁食不禁水16h，(第8天)模型對照組和黨參各劑量組按5mg/kg劑量灌胃給予復(fù)方地芬諾酯溶液。30min后，黨參各劑量組分別給予等濃度的含墨汁溶液，陰性對照組和模型對照組只按照0.2mL/10g BW的容量給予墨汁灌胃。25min后，所有小鼠脫頸處死，打開腹腔小心分離腸系膜，剪取幽門(上端)至回盲部(下端)的腸管，然后置于托盤上輕輕將小腸拉成直線，直尺測量幽門括約肌至小腸回盲部墨汁推進(jìn)的長度(遠(yuǎn)端)及小腸總長度，計算墨汁推進(jìn)率P(%)；另外，取1cm長的結(jié)腸組織，準(zhǔn)確稱重后立即置液氮凍存，用于后期5-HT和VIP含量測定。

小腸推進(jìn)功能以墨汁推進(jìn)率P(%)表示：

{[幽門到墨汁推進(jìn)遠(yuǎn)端間的距離(cm)]/[小腸全長距離(cm)]} ×100%

1.3.3排便實(shí)驗(yàn) 測定首粒排黑便時間、糞便粒數(shù)和糞便重量。按1.3.1分組后，小鼠連續(xù)灌胃7d，之后禁食不禁水16h，(第8天)模型對照組和黨參各劑量組按10mg/kg劑量灌胃給予復(fù)方地芬諾酯溶液。30min后，黨參各劑量組分別給予等濃度的含墨汁溶液，陰性對照組和模型對照組只按照0.2mL/10g·BW的容量給予墨汁灌胃。完成后將小鼠進(jìn)行單籠喂養(yǎng)，恢復(fù)正常飲水進(jìn)食，開始計時，記錄每只小鼠首次排黑便時間、5h內(nèi)排黑便粒數(shù)及糞便總重量。

1.3.4腸組織中5-HT、VIP含量的測定 取液氮凍存的結(jié)腸組織在保持低溫條件下，按1∶9比例加入生理鹽水制備勻漿，離心(3 500r/min)20min，取上清液于-20℃下保存。5-HT、VIP的檢測方法及計算方法均參照上海酶聯(lián)生物科技有限公司的試劑盒說明。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參水提物對便秘小鼠體重的影響

如表1、表2所示，兩個動物模型中模型對照組和黨參不同劑量組小鼠的終體重與陰性對照組進(jìn)行比較，結(jié)果均無顯著性差異(P>0.05)，說明地芬諾酯和黨參水提物對模型小鼠體重?zé)o影響。

表1 小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)中各組小鼠體重

注：與陰性對照組比較，P>0.05

表2 排便實(shí)驗(yàn)中各組小鼠體重的影響

注：與陰性對照組比較，P>0.05

2.2 小鼠小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1、表3可以發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組比較，給予5mg/kg劑量地芬諾酯的模型對照組中小鼠墨汁推進(jìn)距離明顯降低(P<0.01)，表明該劑量的地芬諾酯能夠成功誘導(dǎo)小鼠小腸蠕動抑制模型。與模型對照組比較，黨參水提物3個劑量組中小鼠平均墨汁推進(jìn)率都明顯增加，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，且推進(jìn)率同沒有給予地芬諾酯的陰性對照組接近，說明黨參水提物能夠逆轉(zhuǎn)地芬諾酯導(dǎo)致的小鼠小腸蠕動減緩的情況，提示其可能具有促進(jìn)小腸蠕動的功能(圖2)。

表3 不同劑量黨參水提物對小鼠小腸推進(jìn)的影響

注：與陰性對照組比較，#P>0.01；與模型對照組比較，**P<0.01

2.3 結(jié)腸組織中5-HT、VIP含量測定

如圖3所示，與陰性對照組比較，模型對照組小鼠結(jié)腸組織中的5-HT含量降低、VIP含量升高，并均有顯著性差異(均P<0.01)，模型組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[13，18]。與模型對照組比較，黨參水提物高劑量和低劑量組小鼠結(jié)腸組織中5-HT表達(dá)明顯上升，VIP表達(dá)明顯下降，其中高劑量組有非常顯著差異(P<0.01)，低劑量組有顯著性差異(P<0.05)，表明黨參水提物對小腸蠕動的促進(jìn)作用可能與調(diào)節(jié)5-HT和VIP的水平有關(guān)。

2.4 小鼠排便實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與陰性對照組比較，給予10mg/kg復(fù)方地芬諾酯的模型對照組便秘小鼠首粒排黑便時間明顯延長，5h內(nèi)排黑便總重量明顯減少(P<0.01)，說明小鼠出現(xiàn)明顯便秘癥狀，提示便秘模型成立。受試組與模型對照組比較，不同劑量的黨參水提物對便秘小鼠的首粒排黑便時間、排黑便粒數(shù)以及黑便重量均有一定的改善作用，其中高劑量組能顯著縮短首粒排黑便的時間(P<0.01)，明顯增加5h內(nèi)排黑便總重量(P<0.05)；低劑量組能明顯增加便秘小鼠5h內(nèi)排黑便總重量(P<0.05)。結(jié)果提示，黨參水提物尤其是高劑量情況下對便秘小鼠的排便具有改善作用。

圖1 小鼠小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照進(jìn)行轉(zhuǎn)化，P為推進(jìn)率(%)。與陰性對照組比較，#P<0.01；與模型對照組比較，**P<0.01

圖2 黨參水提物對小鼠結(jié)腸組織中5-HT、VIP含量的影響注：與陰性對照組比較，#P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3 黨參水提物對小鼠首粒排黑便時間、排黑便粒數(shù)和黑便重量的影響注：與陰性對照組比較，#P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05、**P<0.01

3 討論

研究表明，黨參健脾養(yǎng)胃的功能可以促進(jìn)實(shí)驗(yàn)小鼠胃腸運(yùn)動，其主要活性部位可能為黨參多糖[13-14]。本實(shí)驗(yàn)依照CFDA通便功能檢測方法考察了黨參水提物(多糖含量為10%～15%)對小腸墨汁推進(jìn)作用，并首次研究報道其對便秘小鼠排便功能的影響，考察了首粒排便時間、5 h糞便粒數(shù)和糞便總重量等指標(biāo)。結(jié)果表明，黨參水提物高、中、低(3 333～833mg/kg)3個劑量均具有小腸推進(jìn)功能，其中高劑量和低劑量黨參水提物還能夠縮短排便功能中首粒黑便時間，增加排便粒數(shù)和重量。

研究表明，5-HT是胃腸道運(yùn)動和分泌功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)[15]。95%的5-HT來源于腸道黏膜層的嗜鉻細(xì)胞，腸黏膜嗜咯細(xì)胞釋放5-HT，能刺激腸吸收水分從而促進(jìn)腸蠕動，參與胃腸運(yùn)動和分泌功能。本實(shí)驗(yàn)中，復(fù)方地芬諾酯造模組5-HT含量明顯低于陰性對照組，該結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[16]，黨參水提物高、中、低3個劑量組與模型組比較，實(shí)驗(yàn)小鼠腸道內(nèi)5-HT水平有上升趨勢，其中高劑量和低劑量組有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01或P<0.05)，表明黨參水提物可能具有刺激腸道黏膜層的嗜鉻細(xì)胞分泌5-HT的作用，升高腸道內(nèi)5-HT的水平，進(jìn)而促進(jìn)腸蠕動，因此黨參水提物的小腸推進(jìn)功能可能與調(diào)節(jié)腸道內(nèi)5-HT水平有關(guān)。

VIP的主要作用是增強(qiáng)胃腸粘膜的腺體分泌、松弛胃腸道平滑肌、抑制胃腸蠕動[16-17]，與慢傳輸型便秘的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[18-19]，通過抑制胃腸道平滑肌收縮及腸肌緊張性，減少胃腸粘膜的分泌活動，從而抑制腸蠕動導(dǎo)致慢傳輸型便秘。李勇等[20]發(fā)現(xiàn)，VIP在復(fù)方地芬諾酯小鼠便秘模型中含量要明顯高于陰性對照組，認(rèn)為VIP含量的升高可能是便秘早期腸神經(jīng)系統(tǒng)的一種代償性反應(yīng)。本研究采用復(fù)方地芬諾酯誘導(dǎo)了小鼠便秘模型，VIP含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組VIP含量與陰性對照組比較明顯升高了，而給予能促進(jìn)腸蠕動、改善便秘癥狀的黨參水提物組，VIP的含量明顯下降(高劑量、低劑量黨參水提物組與模型組相比較，VIP含量顯著下降，接近于陰性對照組水平)。本實(shí)驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象與文獻(xiàn)報道一致[20]，一方面說明黨參水提物可促進(jìn)小腸運(yùn)動和排便，另一方面也證明VIP含量升高是便秘早期長神經(jīng)的一種代嘗性反應(yīng)。

4 結(jié)論

黨參水提物3個劑量組均具有明顯的小腸推進(jìn)功能，其中高劑量和低劑量能夠顯著增加5-HT水平和降低VIP水平，黨參水提物的促腸推進(jìn)作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)5-HT水平有關(guān)；排便實(shí)驗(yàn)中，高劑量黨參水提物能夠顯著改善便秘小鼠的排便功能(縮短首粒黑便時間，增加黑便總重量)，而低劑量和中劑量對排便功能的3個指標(biāo)有改善的趨勢但部分指標(biāo)無顯著性差異。結(jié)合兩個模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示黨參水提物具有潛在的通便功能。作為藥食同源來源的原料，黨參可以作為通便、改善胃腸道保健品的原料進(jìn)一步開發(fā)?！?/p>