全成分葡萄汁對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠的抗衰老作用

王曉波，宋俊科，張 雯，于子茹，王海港，周啟蒙，杜冠華

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所/北京市藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型是目前較常用的衰老動(dòng)物模型，其衰老反應(yīng)接近于自然衰老[1]。葡萄中含有豐富抗衰老作用的白藜蘆醇等營養(yǎng)成分[2-5]，且主要存在于葡萄籽和葡萄皮中。本實(shí)驗(yàn)分別采用普通榨汁法和破壁法制備普通葡萄汁和全成分葡萄汁，應(yīng)用HPLC-MS測定2種葡萄汁中化合物的含量，利用D-半乳糖、焦糊食物和單蒸水建立小鼠衰老模型，考察2種葡萄汁的抗衰老作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1供試品 巨峰葡萄，產(chǎn)地為河北。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠80只，品系 KM，SPF級(jí)，雄性，體重33～35g，合格證號(hào)SYXK(京)2014-0023購買自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0002。飼養(yǎng)于篩選中心通風(fēng)鼠籠，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d，觀察小鼠狀態(tài)良好后，開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.3試劑 SOD、MDA和GSH-Px檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；D-半乳糖和PMSF，Sigma-Aldrich公司；蛋白裂解液、β-actin、Sirt1、Sirt6、p21、p53，CST公司；BCA蛋白定量試劑盒、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG，康為世紀(jì)公司；蛋白Marker，Thermo Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

JYL-Y8 PLUS營養(yǎng)破壁調(diào)理機(jī)(九陽，中國)；JYL-C051料理機(jī)(九陽，中國)；Agilent 1200高效液相色譜儀(Agilent，美國)；Agilent 6110單四級(jí)桿質(zhì)譜儀(Agilent，美國)；Cascada TM LS water純水儀(Pall，美國)；Spectra Max M5酶標(biāo)儀(Molecular Devices，USA)；熒光倒置顯微鏡(Nikon，Japan)；XS105 DU電子天平(Mettler Toledo，Swiss)；Vortex Genie 2渦旋震蕩儀(Scientific industries，USA)；MiniSpin常溫離心機(jī)(Eppendorf，Germany)；全自動(dòng)生化儀(Toshiba，Japan)；STT-2小鼠跳臺(tái)儀、小鼠自主活動(dòng)箱(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所)。

1.3 方法

1.3.1葡萄汁制備 全成分葡萄汁：準(zhǔn)確稱取洗凈晾干的葡萄500g，加入250mL飲用水，放入營養(yǎng)破壁調(diào)理機(jī)中進(jìn)行處理，轉(zhuǎn)速H級(jí)，時(shí)間20 s/次，共4次。

普通葡萄汁：準(zhǔn)確稱取洗凈晾干的葡萄500g，加入250mL飲用水，放入料理機(jī)中進(jìn)行處理，默認(rèn)轉(zhuǎn)速，時(shí)間20 s/次，共4次。經(jīng)過處理的葡萄汁以200目紗布進(jìn)行過濾，獲得無明顯顆粒的葡萄汁，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.3.2普通與全成分葡萄汁離心后沉淀重量比較 取10mL離心管稱重(W1)后加入5mL普通或破壁處理(全成分)的葡萄汁，稱重并記錄重量(W2)，以1 000r/min轉(zhuǎn)速離心20min，吸取上清液，稱取沉淀和管的重量(W3)。計(jì)算葡萄汁中固體沉淀物重量(W3-W1)。

1.3.3普通與全成分葡萄汁過200目篩后未濾過物重量比較 取1.5mL空EP管稱重(W1)后向空EP管中加入500μL葡萄汁，稱重并記錄重量(W2)，再用移液槍吸出葡萄汁過200目篩至同一EP管中，稱取EP管+濾過液體重量(W3)。計(jì)算未濾過物重量(W3-W2)。

1.3.4葡萄汁中化學(xué)成分檢測液相質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(3.5μm，2.1mm×100mm)，柱溫30℃，進(jìn)樣量為10μL，紫外檢測信號(hào)288nm，流動(dòng)相為含甲酸0.02%的水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脫(表1)。

表1 梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜檢測采用的離子源為電噴霧離子源(ESI源)，采用負(fù)離子檢測模式，分別采用全掃描模式和單離子監(jiān)測模式對(duì)潛在化合物進(jìn)行預(yù)測。

質(zhì)譜檢測參數(shù)為Fragmentor = 150 V；Gain = 1.5；Drying Gas Flow = 10.0L/min；Nebulizer Pressure = 35 psig；Drying Gas Temperature = 350°C；Capillary Pressure = 3 000(positive)，3 000(negative)。單離子監(jiān)測模式監(jiān)測的m/z見表2。

表2 單離子監(jiān)測模式檢測的離子m/z和對(duì)應(yīng)的目標(biāo)化合物

1.3.5動(dòng)物分組與給藥 80只小鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、模型組(衰老模型組)、普通葡萄汁組和全成分葡萄汁組。正常對(duì)照組動(dòng)物每日皮下注射150mg/kg的生理鹽水，給予常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水；其余3組動(dòng)物每日皮下注射150mg/kg的D-gal溶液[4]，同時(shí)給予單蒸水代替自來水、120℃烘焙12 h后的飼料代替普通維持飼料，連續(xù)7w[4]。于造模的第3周開始，每天小鼠禁水2 h后分別自由飲用自來水和不同葡萄汁6 h。

1.3.6小鼠體重、飲水量與形態(tài)觀察 4組動(dòng)物于每天給藥前稱重，記錄體重、飲水量、葡萄汁飲用量和小鼠形態(tài)變化。

1.3.7自主活動(dòng)測定 將小鼠放入自主活動(dòng)儀活動(dòng)箱中，測定前每只小鼠先適應(yīng)環(huán)境1min，然后由記錄儀自動(dòng)記錄3min內(nèi)小鼠自發(fā)活動(dòng)次數(shù)。

1.3.8跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 跳臺(tái)裝置為l0cm *10cm *28cm的被動(dòng)條件反射箱，四周為黑色塑料板、底面鋪可通電的銅柵，每間內(nèi)放置一高3cm、直徑4cm的橡皮墊作為動(dòng)物回避電擊的安全區(qū)，先將小鼠放在反應(yīng)箱內(nèi)的橡皮臺(tái)上適應(yīng)3min，然后立即通以40V交流電，小鼠自開始至第1次跳下橡皮臺(tái)的時(shí)間為潛伏期。小鼠跳下橡皮臺(tái)，受到電擊后逃避反應(yīng)為跳上橡皮臺(tái)。記錄5min內(nèi)小鼠跳下橡皮臺(tái)后受到電擊次數(shù)，稱為錯(cuò)誤次數(shù)。小鼠于實(shí)驗(yàn)開始前一天進(jìn)行3次學(xué)習(xí)適應(yīng)，24h后在底部銅柵通電情況下，直接將動(dòng)物置于平臺(tái)上，記錄第1次跳下的潛伏期和5min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)。

1.3.9臟器指數(shù)的測定 取血后，取小鼠腦、肝、腎，取出后在生理鹽水中清洗表面的血跡，吸水紙上吸干水分，稱量重量并拍照，計(jì)算臟器指數(shù)。

1.3.10HE染色 每組取3只小鼠，用于腎臟病理檢測：腹腔注射10%水合氯醛(3.5mL/kg)麻醉。依次剪開皮膚、胸腔，充分暴露心臟，以灌注針穿透心尖，進(jìn)入左心室，朝主動(dòng)脈方向插入，用蠕動(dòng)泵(調(diào)整流速為65r/min)輸注生理鹽水，于右心耳下部剪開右心房，至流出液變清，換用4%多聚甲醛溶液繼續(xù)灌注，至肝臟發(fā)白、動(dòng)物全身僵硬為止，然后斷頭取腦，放入4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定24 h。石蠟包埋，將修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)上連續(xù)切片，片厚4μm，進(jìn)行蘇木素—伊紅(HE)染色。

1.3.11小鼠肝組織SOD、GSH-Px和MDA含量 迅速剝離各組小鼠腎臟，預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，制備10%腎臟勻漿，3 000r/min，4℃離心10min，取上清。測定腎臟中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性和丙二醛(MDA)含量。

1.3.12Western blot分析 Western blot法檢測Sirt1、Sirt6和p21等蛋白表達(dá)變化，提取組織、細(xì)胞總蛋白或用細(xì)胞核與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒分別提取細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量。加入SDS上樣品緩沖液，沸水浴10min，以同等蛋白含量進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，然后用5% BSA室溫封閉2 h，加入稀釋后的一抗，4°C孵育過夜；TBST洗3次，每次10min；加入相應(yīng)的二抗稀釋液，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10min；用ECL發(fā)光法檢測不同樣品各種蛋白表達(dá)情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以Mean ± SD表示，應(yīng)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間差異采用Tukey’s post hoc test計(jì)算，兩組數(shù)據(jù)采用非配對(duì)t檢驗(yàn)計(jì)算，P<0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通葡萄汁與全成分葡萄汁離心后沉淀物重量比較

由圖1可知，全成分葡萄汁離心后沉淀物的重量較普通葡萄汁中沉淀物的重量低(P<0.01)，表明葡萄經(jīng)破壁處理后有更多物質(zhì)混懸到溶液中，導(dǎo)致其沉淀重量較輕。

圖1 普通葡萄汁與全成分葡萄汁離心后沉淀物重量

2.2 普通葡萄汁與全成分葡萄汁過200目篩后未濾過重量比較

圖2 普通葡萄汁與全成分葡萄汁過200目篩未濾過顆粒重量

由圖2可知，經(jīng)由200目篩過濾后，全成分葡萄汁未濾過顆粒重量明顯輕于普通葡萄汁未濾過顆粒重量(P<0.05)，表明全成分葡萄汁中的顆粒物質(zhì)明顯少于普通葡萄中的顆粒物質(zhì)，提示破壁處理得到的全成分葡萄汁更加細(xì)膩。

2.3 HPLC-MS法比較全成分與普通葡萄汁中化合物含量差別

2.3.1全成分與普通葡萄汁中白藜蘆醇相對(duì)含量比較從圖3A中可以明顯看出，全成分葡萄汁中白藜蘆醇的含量明顯高于普通葡萄汁中白藜蘆醇的釋放量，2種葡萄汁中的白藜蘆醇含量有顯著差異(P<0.01)。

2.3.2全成分與普通葡萄汁中山奈酚的相對(duì)含量比較從圖4A中可以明顯看出，全成分葡萄汁中山奈酚的釋放量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通葡萄汁中山奈酚的釋放量(P<0.05)。

2.3.3全成分與普通葡萄汁中槲皮素的相對(duì)含量比較從圖5A中可以明顯看出，全成分葡萄汁中槲皮素的釋放量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通葡萄汁中槲皮素的釋放量(P<0.05)。

2.3.4全成分與普通葡萄汁中蘆丁的相對(duì)含量比較從圖6A中可以明顯看出，全成分葡萄汁中蘆丁的釋放量顯著低于普通葡萄汁中蘆丁的釋放量(P<0.01)，這一結(jié)果與筆者預(yù)期的結(jié)果相反，但考慮到蘆丁屬于黃酮與糖的結(jié)合物(黃酮苷)，因此，猜測可能是在全成分與普通處理過程中，蘆丁可能脫掉糖分子，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為苷元的結(jié)果。而全成分與普通處理過程蘆丁轉(zhuǎn)化為苷元的效率不同，造成了實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相反。

2.4 小鼠葡萄汁飲用量統(tǒng)計(jì)

每天給予小鼠葡萄汁開始和結(jié)束時(shí)，使用量筒準(zhǔn)確計(jì)量每組給葡萄汁的量，以體積表示，計(jì)算得出每只小鼠每天飲用葡萄汁量并比較兩組差異。圖7顯示，兩者在飲用量上無顯著性差異(P>0.05)，表明葡萄汁所起的藥效作用是相同劑量標(biāo)準(zhǔn)下的。

2.5 小鼠外觀狀態(tài)拍攝

造模及飲用葡萄汁7w后，對(duì)小鼠進(jìn)行多方位拍攝，并觀察小鼠外觀及精神狀態(tài)。從圖8中可明顯看出，正常組小鼠毛色光亮柔順，精神狀態(tài)良好，健康活潑好動(dòng)。衰老模型組小鼠，毛色發(fā)暗、臟亂，且有毛發(fā)稀疏的現(xiàn)象。同時(shí)，模型組小鼠萎靡虛弱，四肢無力，呈趴伏蜷縮態(tài)且有弓背現(xiàn)象，出現(xiàn)了顯著的衰老特征。全成分葡萄汁組小鼠與正常組小鼠基本相同，甚至更優(yōu)于正常組。普通葡萄汁組小鼠的外觀及狀態(tài)介于正常組與模型組之間，說明葡萄汁對(duì)小鼠衰老模型所造成的外在狀態(tài)有改善作用，且全成分組優(yōu)于普通組。

2.6 小鼠體重變化

統(tǒng)計(jì)每周小鼠體重并記錄，比較各組小鼠體重變化差異。從圖9中可以看出，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第7周，隨著造模的進(jìn)行，各組小鼠體重均有穩(wěn)定增長，增長到峰值后略有波動(dòng)，但最終各組小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。衰老模型在體重衰減方面與對(duì)照組無顯著性差異，給予葡萄汁也沒有影響小鼠的體重指標(biāo)。

圖3 全成分與普通葡萄汁中白藜蘆醇相對(duì)含量比較A葡萄汁中白藜蘆醇含量；B白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子流色譜圖；C全成分葡萄汁選擇離子流色譜圖；D普通葡萄汁選擇離子流色譜圖([M-H]-，m/z=227)

圖4 全成分與普通葡萄汁中山奈酚相對(duì)含量比較A葡萄汁中山奈酚含量；B山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子流色譜圖；C全成分葡萄汁選擇離子流色譜圖；D普通葡萄汁選擇離子流色譜圖([M-H]-，m/z=285)

圖5 全成分與普通葡萄汁中槲皮素相對(duì)含量比較A葡萄汁中槲皮素含量；B槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子流色譜圖；C全成分葡萄汁選擇離子流色譜圖；D普通葡萄汁選擇離子流色譜圖([M-H]-，m/z=301)

圖6 全成分與普通葡萄汁中蘆丁相對(duì)含量比較A葡萄汁中蘆丁含量；B蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子流色譜圖；C全成分葡萄汁選擇離子流色譜圖；D普通葡萄汁選擇離子流色譜圖([M-H]-，m/z=609)

圖8 小鼠外觀狀態(tài)

圖10 小鼠自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 小鼠行為學(xué)改變檢測

2.7.1小鼠自主活動(dòng) 4組之間采取平行試驗(yàn)的方法，共4個(gè)暗箱，每次各取每組1只放入暗箱試驗(yàn)。從圖10中可以看出，小鼠模型組自主活動(dòng)與正常對(duì)照組相比顯著減少(P<0.01)，全成分與普通組均可增加小鼠的自主活動(dòng)數(shù)，且全成分組的自主活動(dòng)數(shù)多于普通組。

2.7.2小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 從圖11A中可以看出，經(jīng)過1d學(xué)習(xí)記憶之后，模型組與正常對(duì)照組相比潛伏期顯著縮短(P<0.001)，給予葡萄汁組與模型組相比潛伏期有所增加，其中，全成分葡萄汁組對(duì)潛伏期變短的改善有著顯著性的作用(P<0.05)。從圖11B中可以看出，模型組與正常對(duì)照組相比犯錯(cuò)次數(shù)均增加(P<0.01)，給予葡萄汁組對(duì)犯錯(cuò)次數(shù)有改善作用，其中，全成分葡萄汁組與模型組相比改善作用有著顯著性差異(P<0.05)。

2.8 小鼠肝、腎、腦臟器指數(shù)變化

取材時(shí)每只小鼠稱量體重及肝、腎(兩側(cè)腎)、腦3種臟器重量，計(jì)算得每只小鼠不同臟器指數(shù)，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算差異。組織器官的重量，特別是腦、肝、腎等重要器官的重量變化是反映機(jī)體衰老程度的重要指標(biāo)。從圖12A中可以看出，模型組小鼠與正常對(duì)照組相比，肝臟指數(shù)增加(P<0.001)，應(yīng)為炎癥或水腫、充血所致，而全成分與普通組均有改善作用，其中全成分組的改善作用有顯著性(P<0.05)。各組小鼠腎臟器指數(shù)無明顯差異(圖12B)。另外，從圖12C中可以看出，全成分組與普通組相比，腦臟器指數(shù)有顯著性改善作用(P<0.05)。

2.9 小鼠肝臟組織抗氧化酶及氧化酶測定

SOD是一種存在于細(xì)胞液中的抗氧化酶，其活性的高低間接反映了組織抗氧化的能力[5]。從圖13A中可以看出，與正常對(duì)照組相比，模型組肝組織中SOD活性降低，給予葡萄汁組對(duì)此均有改善作用，其中全成分組葡萄汁有著顯著的改善作用(P<0.05)。GSH-Px是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)，進(jìn)一步反映了小鼠衰老的情況。如圖13B所示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織中GSH-Px活性降低，全成分組相對(duì)于模型組能顯著提高GSH-Px水平(P<0.001)，并且全成分組的GSH-Px水平也顯著高于普通組(P<0.001)。MDA是機(jī)體內(nèi)的自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化的一種產(chǎn)物，常被作為評(píng)價(jià)衰老的一種指標(biāo)。如圖13C，衰老模型組小鼠相對(duì)正常對(duì)照組MDA含量顯著增高(P<0.001)，全成分葡萄汁組相對(duì)于模型組可以顯著降低MDA的含量(P<0.001)，并且全成分葡萄汁組的MDA含量也顯著低于普通葡萄汁組(P<0.01)。

圖7 給葡萄汁兩組小鼠每天飲葡萄汁量

圖11 小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果A潛伏期；B錯(cuò)誤次數(shù)

圖12 小鼠肝、腎和腦臟器指數(shù)變化A肝臟器指數(shù)；B腎臟器指數(shù)；C腦臟器指數(shù)

圖13 小鼠腎臟器氧化酶及抗氧化酶檢測A SOD；B GSH-Px；C MDA

2.10 小鼠腎臟HE染色病理切片

HE染色可見小鼠腎臟組織形態(tài)發(fā)生變化(圖14)，模型組小鼠與正常組小鼠相比，腎小球腫脹，出現(xiàn)明顯的體積增大和細(xì)胞增多，與周圍組織間隙變小(圖中箭頭所指位置)。腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞水腫，也就是常說的顆粒變性或空泡變性，且腎小管上皮細(xì)胞有壞死脫落和水腫，乃至腎小管管腔消失。全成分組與普通組上述病變形態(tài)均有一定改善，且全成分組優(yōu)于普通組的改善情況。

圖14 小鼠肝臟HE染色病理切片

2.11 Western blot檢測不同蛋白含量

Western blot法測各組小鼠腦組織中FOXO3a、Sirt1、Sirt6、p53和p21蛋白表達(dá)水平。從圖14可以看出，模型組相對(duì)于正常對(duì)照組FOXO3a蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.001)，全成分組與普通組的FOXO3a蛋白表達(dá)量與模型組相比均有所降低(圖15A)。從圖15B中可以看出，模型組相對(duì)于正常對(duì)照組Sirt1蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，全成分組與普通組的Sirt1蛋白表達(dá)量與模型組相比均有所升高，其中，全成分組Sirt1蛋白表達(dá)量相對(duì)于模型組具有顯著性差異(P<0.05)。模型組相對(duì)于正常對(duì)照組p53蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，全成分組與普通組的Sirt1蛋白表達(dá)量與模型組相比均有所升高，其中，全成分組Sirt1蛋白表達(dá)量相對(duì)于模型組具有顯著性差異(P<0.05)(圖15B)。與正常對(duì)照組相比，模型組p53蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.001)，全成分組與普通組的Sirt6蛋白表達(dá)量與模型組相比均略有所升高，且全成分組的作用更好(圖15C)。與正常對(duì)照組相比，模型組Sirt6蛋白表達(dá)有所降低，全成分組與普通組的Sirt6蛋白表達(dá)量與模型組相比均略有所升高，且全成分組的作用更好(圖15D)。從圖15E中可以看出，模型組相對(duì)于正常對(duì)照組p21蛋白的表達(dá)量有所增高，全成分組與普通組的p21蛋白表達(dá)量與模型組相比均有所降低。

3 討論與結(jié)論

葡萄是一種營養(yǎng)價(jià)值高的食物，其中所含有的白藜蘆醇等成分有著顯著的抗氧化、抗衰老作用[4-9]，但上述成分多存在于葡萄皮及葡萄籽中[1-3]。由于其口感粗糙生澀難以下咽，且食用后也不易于被人體消化吸收，常常被丟棄，不僅造成極大浪費(fèi)，也難以發(fā)揮葡萄在生活中應(yīng)有的抗衰老作用。破壁處理后的葡萄，能更多釋放出原本存在皮和籽中的上述抗衰老物質(zhì)，更利于被人體消化吸收，發(fā)揮作用。本研究結(jié)果表明，全成分葡萄汁中更多的營養(yǎng)物質(zhì)得以釋放而應(yīng)用，其中，白藜蘆醇、山奈酚和槲皮素含量均顯著高于普通葡萄汁。

在對(duì)衰老的預(yù)防和治療研究中，鑒于小鼠基因和人類基因的相似性以及小鼠生命周期短暫，藥物的抗衰老活性研究多通過建立小鼠衰老模型來檢驗(yàn)藥物的抗衰老效果。D-半乳糖注射法因其簡便易行，現(xiàn)多用于抗衰老試驗(yàn)研究[1，10]。實(shí)驗(yàn)小鼠皮下注射150mg/kg D-gal后，小鼠自主活動(dòng)次數(shù)明顯減少；跳臺(tái)潛伏期顯著縮短、錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加；肝臟指數(shù)明顯增加，并引起的腎小球腫脹及腎小管上皮細(xì)胞水腫；抗氧化酶SOD的含量和GSH-Px水平顯著降低，脂質(zhì)過氧化物MDA含量明顯升高；促衰老蛋白FOXO3a、p21的表達(dá)顯著升高而抗衰老蛋白Sirt1、Sirt6的表達(dá)水平顯著降低[11-13]。由此可見，應(yīng)用D-gal皮下注射造成小鼠衰老模型，可以用來觀察不同葡萄汁的抗衰老作用。

連續(xù)7w分別給予2組實(shí)驗(yàn)小鼠普通葡萄汁和全成分葡萄汁，均能夠增加D-gal導(dǎo)致的小鼠自主活動(dòng)次數(shù)的減少，延長跳臺(tái)潛伏期、減少錯(cuò)誤次數(shù)、提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。飲用全成分葡萄汁能夠顯著改善D-gal導(dǎo)致的小鼠肝臟指數(shù)增加和腎小球腫脹及腎小管上皮細(xì)胞水腫的病理狀態(tài)，提高抗氧化酶SOD、GSH-Px的含量，抑制脂質(zhì)過氧化物MDA含量的升高，同時(shí)能夠降低促衰老蛋白FOXO3a、p21的表達(dá)，促進(jìn)抗衰老蛋白Sirt1、Sirt6的表達(dá)。在相同飲用量的情況下，全成分葡萄汁抗衰老效果要優(yōu)于普通葡萄汁。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，全成分葡萄汁能夠明顯抵抗小鼠的衰老反應(yīng)，其抗衰老效果優(yōu)于普通葡萄汁。這為日?？顾ダ咸峁┝艘环N行之有效的食療方法。◇

圖15 Western blot檢測不同蛋白含量A FOXO3a；B Sirt1；C p53；D Sirt1；E p21；F Western blot灰度圖