調(diào)經(jīng)贊育丸抑制催產(chǎn)素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的作用研究

王婧婧 王 張

1.成都市第七人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川成都 610021；2.成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，四川成都 611137

調(diào)經(jīng)贊育丸由人參、韭菜子、當歸、蛇床子、益母草、川芎、薏苡仁、蟾酥等組成，具有補益腎氣、調(diào)經(jīng)贊育等功能，臨床上主要用于女性腎陽虛損、月經(jīng)紊亂、痛經(jīng)、性欲減退、功能性不孕癥等癥，屬于虛實夾雜、以虛為主的病證。針對腎的陰陽虧虛，應陰陽雙補[1]，正如張景岳《景岳全書》曰：“善補陽者，必于陰中求陽，則陽得陰助而生化無窮；善補陰者，必于陽中求陰，則陰得陽升而泉源不竭。”方中人參、韭菜子補益腎氣，助腎陽，共為君藥；當歸、益母草、川芎活血調(diào)經(jīng)，兼補氣血，為臣；蛇床子、薏苡仁、蟾酥以通絡(luò)，為佐使之劑。全方共奏補益腎氣、調(diào)經(jīng)贊育之功。孫嘉敏等[2]研究了調(diào)經(jīng)贊育丸對雄激素致不孕大鼠生育功能的治療作用及其機制，結(jié)果提示調(diào)經(jīng)贊育丸能明顯增加大鼠卵巢中各級卵泡總數(shù)和黃體數(shù)，能明顯恢復大鼠的動情周期和排卵功能，降低大鼠血清中的總睪丸酮含量，還能明顯升高大鼠血清中雌二醇和卵泡刺激素含量。

痛經(jīng)為最常見的婦科癥狀之一，指行經(jīng)前后或月經(jīng)期出現(xiàn)下腹部疼痛、墜脹，伴有腰酸或其他不適，嚴重影響生活質(zhì)量。痛經(jīng)分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，原發(fā)性痛經(jīng)指生殖器官無器質(zhì)性病變的痛經(jīng)；繼發(fā)性痛經(jīng)指由盆腔器質(zhì)性疾病，如子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病等引起的痛經(jīng)。原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)生主要與月經(jīng)時子宮內(nèi)膜前列腺素含量增高有關(guān)。前列腺素F2α（PGF2α）含量升高是造成痛經(jīng)的主要原因[3]。 PGF2α含量高可引起子宮平滑肌過強收縮，血管痙攣，造成子宮缺血、乏氧狀態(tài)而出現(xiàn)痛經(jīng)[4]。張麗梅等[5]觀察了調(diào)經(jīng)贊育丸對痛經(jīng)的治療作用，發(fā)現(xiàn)其能延長催產(chǎn)素、PGF2α所致小鼠痛經(jīng)扭體潛伏時間，減少痛經(jīng)扭體反應次數(shù)。但是，調(diào)經(jīng)贊育丸治療痛經(jīng)的現(xiàn)代藥理學機制尚未闡明。故本研究應用苯甲酸雌二醇和催產(chǎn)素聯(lián)合的方法來制備痛經(jīng)大鼠子宮平滑肌體外模型[6]，進一步從器官水平探討調(diào)經(jīng)贊育丸治療痛經(jīng)的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD 大鼠，SPF級，雌性，100只，20周齡左右，體重300 g左右，由成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-24，實驗動物質(zhì)量合格證號：0015873。實驗動物鼠配合飼料由成都達碩實驗動物有限公司提供，執(zhí)行標準為GB14924.3-2010，將飼料放置于大鼠籠蓋前面的飼養(yǎng)槽內(nèi)，自由攝食。飲用水為生活用自來水，符合《生活飲用水衛(wèi)生標準》（GB5749-2006），飲用水瓶放置于大鼠籠蓋前面的專用位置，自由飲水。

動物飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學（以下簡稱“我?！保亟^(qū)科技樓，實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2014-124，處死前適應性飼養(yǎng)3～7 d。實驗觀察于我校民族藥資源評價實驗室（國家中醫(yī)藥管理局三級科研實驗室，TCM-2009-320）進行。

動物實驗研究的全程遵循了中國人民共和國國家標準 《實驗動物福利倫理審查指南》（GB T 35892-2018）中的有關(guān)實驗動物保護和使用的指南，并經(jīng)我校實驗動物倫理委員會批準。

1.2 試驗藥物

調(diào)經(jīng)贊育丸由我校自制（批號：20171013），成人的日用劑量為3.10 g素丸，將其用洛氏液作為溶劑配制成（素丸）濃度為0.1856 g/mL的混懸液。將50、100、200 μL藥液加入50 mL浴槽后，相應的藥物終濃度分別為 0.1854、0.3705、0.7394 mg/mL。黃體酮注射液（陽性對照藥）由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為20 mg/mL，批號為170424。將50 μL藥液加入 50 mL的浴槽后，相應的藥物終濃度為0.02 mg/mL。苯甲酸雌二醇注射液（致敏試劑）由天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為1 mg/mL，批號為1709171；縮宮素注射液（催產(chǎn)素注射液，造模工具藥）由安徽豐原藥業(yè)股份有限公司馬鞍山藥廠生產(chǎn)，規(guī)格為10 U/mL，批號為170823-1；將50 μL藥液加入50 mL的浴槽后，相應的藥物終濃度為0.01 U/mL。

1.3 儀器

生物信號采集處理系統(tǒng)（BL-420F型）、恒溫平滑肌實驗系統(tǒng)（HW200S型）和生物張力傳感器（FT-100型），均由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)。

1.4 試劑

洛氏液（配方為氯化鈉9.2 g/L、氯化鉀0.42 g/L、碳酸氫鈉0.5 g/L、氯化鈣0.06 g/L先單獨溶解后再加入，葡萄糖0.5 g/L臨用時才加入[7]）；氯化鈉由焦堿集團化學試劑廠生產(chǎn)（批號：20160809）；氯化鉀由成都化學試劑廠生產(chǎn)（批號：170413）；碳酸氫鈉由上海虹光化工廠生產(chǎn)（批號：160514）；氯化鈣由天津市塘沽鄧中化工廠生產(chǎn)（批號：20161108）；葡萄糖由四川菲德力制藥有限公司生產(chǎn)（批號：171024）。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物分組 將大鼠按照體重分層，再隨機分為六組，即空白對照組、模型對照組、黃體酮對照組[8]、調(diào)經(jīng)贊育丸低濃度組、調(diào)經(jīng)贊育丸中濃度組和調(diào)經(jīng)贊育丸高濃度組。其中，空白對照組、模型對照組和黃體酮對照組每組5～10只動物，而調(diào)經(jīng)贊育丸低、中、高濃度組每組10～20只動物。

1.5.2 雌激素增敏 實驗前24 h按0.8 mL/只給大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇[9]，人工促使其處于動情期或動情前期，以提高子宮平滑肌對藥物的敏感性。

1.5.3 儀器準備 調(diào)節(jié)儀器的溫度調(diào)節(jié)旋鈕使恒溫在（37.0±0.5）℃，并將洛氏液放置其中，以保持在相同溫度。調(diào)整壓力傳感器和生物信號采集處理系統(tǒng)，使其正常工作，調(diào)零并定標。

1.5.4 制備離體子宮平滑肌 取大鼠，股靜脈放血處死，立即剖開腹腔，取出子宮并輕輕剝離其周圍的脂肪組織，并用洛氏液將腸內(nèi)容物沖洗干凈，置于已經(jīng)溫熱的洛氏液中（注意通氣），將子宮剪成1.5～2.5 cm的片段2～4段（當天使用，不要過夜）[10]。子宮片斷兩端穿線接扎，一端系于通氣鉤上，然后輕輕放入恒溫浴槽中，另一端系于壓力轉(zhuǎn)感器上，再連接記錄儀。通氧氣調(diào)節(jié)速度為1～2 s出現(xiàn)1個氣泡，但不能影響平滑肌的自主舒縮運動。

1.5.5 操作步驟 先觀察正常子宮的運動，調(diào)整浴槽內(nèi)子宮平滑肌張力（給予1～2 g前負荷，使子宮平滑肌有一定的緊張度），使舒縮穩(wěn)定1～2 min后，先描記一段子宮平滑肌正常運動的曲線，然后再向浴槽中滴加各種藥液，并記錄相應的舒縮曲線。

1.5.6 觀察調(diào)經(jīng)贊育丸對正常大鼠離體子宮平滑肌的影響 ①記錄正常值（觀察1～2 min）；②加入調(diào)經(jīng)贊育丸溶液50 μL（觀察1 min）；③1 min后再加入調(diào)經(jīng)贊育丸溶液50 μL（觀察1 min）；④1 min后再加入調(diào)經(jīng)贊育丸溶液 100 μL（觀察 5 min）[11]。

1.5.7 觀察催產(chǎn)素對正常大鼠離體子宮平滑肌的影響①記錄正常值（觀察1～2 min）；②10 min后加入催產(chǎn)素 50 μL（觀察 5 min）。

1.5.8 觀察黃體酮對催產(chǎn)素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響 ①記錄正常值（觀察1～2 min）；②加入催產(chǎn)素50 μL（觀察1 min）；③1 min后加入黃體酮溶液50 μL（觀察 5 min）。

1.5.9 觀察調(diào)經(jīng)贊育丸對催產(chǎn)素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響 ①記錄正常值（觀察1～2 min）；②10 min后加入催產(chǎn)素 50 μL（觀察1 min）；③1 min后加入調(diào)經(jīng)贊育丸溶液50 μL（觀察 1 min）；④1 min后再加入調(diào)經(jīng)贊育丸溶液50 μL（觀察1 min）；⑤1 min后再加入調(diào)經(jīng)贊育丸溶液 100 μL（觀察 5 min）。

1.5.10 測試指標 記錄給藥前后子宮平滑肌的收縮變化，分別對以下指標進行統(tǒng)計學處理[12]：平均張力值；頻率；活動度（活動度=平均張力值×頻率）。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 調(diào)經(jīng)贊育丸對正常大鼠離體子宮平滑肌的影響

調(diào)經(jīng)贊育丸低、中、高濃度組與空白對照組平均張力、頻率和活動度比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示調(diào)經(jīng)贊育丸對正常大鼠離體子宮平滑肌收縮的平均張力、頻率和活動度沒有明顯的影響。見表1。

表1 調(diào)經(jīng)贊育丸對正常大鼠離體子宮平滑肌的影響（±s）

表1 調(diào)經(jīng)贊育丸對正常大鼠離體子宮平滑肌的影響（±s）

注：“-”表示無數(shù)據(jù)

組別 樣本數(shù)（條）終濃度（mg/mL）平均張力值（g）頻率（次/min） 活動度空白對照組調(diào)經(jīng)贊育丸低濃度組調(diào)經(jīng)贊育丸中濃度組調(diào)經(jīng)贊育丸高濃度組10 10 10 10-0.1854 0.3705 0.7394 4.45±2.74 4.69±2.88 4.81±2.97 4.50±3.08 1.52±0.74 1.45±1.12 1.46±1.65 1.65±0.48 6.89±4.12 6.91±5.14 7.12±4.15 6.94±6.01

2.2 催產(chǎn)素收縮大鼠離體子宮平滑肌的作用

模型對照組平均張力值和活動度均明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示模型制備成功。見表2。

表2 催產(chǎn)素對大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

表2 催產(chǎn)素對大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別 樣本數(shù)（條）終濃度（U/mL）平均張力值（g）頻率（次/min） 活動度空白對照組模型對照組10 10-0.01 4.75±2.84 8.63±4.74*1.53±0.46 1.48±0.34 7.14±4.69 11.37±6.91*

2.3 黃體酮對催產(chǎn)素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響

黃體酮對照組的平均張力值和活動度均明顯低于模型對照組（P＜0.05或P＜0.01），但兩組頻率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 黃體酮對催產(chǎn)素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

表3 黃體酮對催產(chǎn)素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

注：與模型對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別 樣本數(shù)（條）終濃度（mg/mL）平均張力值（g）頻率（次/min） 活動度模型對照組黃體酮對照組10 10-0.02 4.58±1.94 1.15±0.87**1.38±0.77 1.24±0.41 6.75±2.19 1.68±1.21*

2.4 調(diào)經(jīng)贊育丸對催產(chǎn)素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響

調(diào)經(jīng)贊育丸中、高濃度組平均張力值明顯低于模型對照組（P＜0.05），調(diào)經(jīng)贊育丸高濃度組活動度明顯低于模型對照組（P＜0.05），但調(diào)經(jīng)贊育丸低、中、高濃度組的頻率與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05）。 見表 4。

表4 調(diào)經(jīng)贊育丸對催產(chǎn)素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

表4 調(diào)經(jīng)贊育丸對催產(chǎn)素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

注：與模型對照組比較，*P＜0.05；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別 樣本數(shù)（條）終濃度（mg/mL）平均張力值（g）頻率（次/min） 活動度模型對照組調(diào)經(jīng)贊育丸低濃度組調(diào)經(jīng)贊育丸中濃度組調(diào)經(jīng)贊育丸高濃度組10 10 10 10-0.1854 0.3705 0.7394 4.61±2.52 2.34±1.52 2.16±1.26*2.05±1.34*1.42±0.29 1.43±0.57 1.35±0.81 1.41±0.99 6.62±2.35 3.42±2.02 3.12±1.58 2.94±1.35*

3 討論

原發(fā)性痛經(jīng)是婦科常見疾病，以經(jīng)期或行經(jīng)前后周期性小腹疼痛或痛引腰骶為主要癥狀，臨床發(fā)病率較高。原發(fā)性痛經(jīng)與子宮內(nèi)膜前列腺素合成、分泌關(guān)系密切，從而引起子宮平滑肌不協(xié)調(diào)收縮、甚至痙攣性收縮，造成子宮供血不足，導致厭氧代謝物積貯，刺激痛覺神經(jīng)元而引起痛經(jīng)。治療主要采用解痙鎮(zhèn)痛劑、前列腺素合成酶抑制劑、鈣離子通道阻滯劑等[13-14]。中醫(yī)學認為，痛經(jīng)的發(fā)生與沖任、胞宮的周期性生理變化密切相關(guān)，主要病機在于邪氣內(nèi)伏或精血素虧，更值經(jīng)期前后沖任二脈氣血的生理變化急驟，導致胞宮的氣血運行不暢，“不通則痛”，或胞宮失于濡養(yǎng)，“不榮則痛”，故使痛經(jīng)發(fā)作[15-16]；常見的分型有腎氣虧損、氣血虛弱、氣滯血瘀、寒凝血瘀和濕熱蘊結(jié)[17-18]。調(diào)經(jīng)贊育丸具有補益女性腎陽虛損的功能，適用于腎氣虧損型痛經(jīng)；現(xiàn)代研究認為，人參[19]、韭菜子[20]能興奮下丘腦-垂體-性腺軸，當歸、益母草[21]具有較好的調(diào)經(jīng)止痛功能，川芎的提取物對大鼠子宮平滑肌的收縮有抑制作用[22]，均有利于痛經(jīng)的治療。

本研究通過雌激素增強大鼠子宮活動度，提高子宮平滑肌對催產(chǎn)素的敏感性，而后者可使子宮平滑肌收縮引起疼痛，從而運用苯甲酸雌二醇和催產(chǎn)素聯(lián)合的方法來制備類痛經(jīng)大鼠子宮平滑肌體外模型，符合人類原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病機制[23]。結(jié)果表明，催產(chǎn)素可導致大鼠離體子宮平滑肌收縮，具體表現(xiàn)為平均張力和活動度增加，但是對收縮頻率沒有明顯影響。張麗梅等[5]觀察到調(diào)經(jīng)贊育丸對小鼠痛經(jīng)具有明顯的治療作用，可能與其降低子宮平滑肌對催產(chǎn)素和PGF2α等激素的敏感性有關(guān)。本研究進一步從體外角度證實了調(diào)經(jīng)贊育丸對痛經(jīng)的治療作用可能與抑制子宮平滑肌收縮有關(guān)。調(diào)經(jīng)贊育丸中濃度（0.3705 mg/mL）和高濃度（0.7394 mg/mL）能明顯抑制催產(chǎn)素致大鼠子宮平滑肌收縮，主要表現(xiàn)為平均張力和活動度的抑制作用，對收縮頻率亦沒有明顯的影響。但是，調(diào)經(jīng)贊育丸對正常大鼠離體子宮平滑肌收縮的平均張力、頻率和活動度都沒有明顯的影響。本研究為調(diào)經(jīng)贊育丸補益腎氣、調(diào)經(jīng)贊育功能的闡釋奠定了藥理學基礎(chǔ)。

但是本研究未對調(diào)經(jīng)贊育丸抑制催產(chǎn)素致大鼠子宮平滑肌收縮的機制進行深入研究，如可探討調(diào)經(jīng)贊育丸對子宮平滑肌 M、β、H1、H2[24]、κ、μ[25]受體的影響，此外，還可利用成分分析、系統(tǒng)溶劑法、血清藥物化學等現(xiàn)代分離分析手段揭示其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。