醬香型白酒釀造過程中微生物及其代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展

戴奕杰，李宗軍，田志強(qiáng)，孟望霓

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128； 2.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，貴州貴陽550016）

中國白酒作為世界著名蒸餾酒之一，其獨(dú)特的固體發(fā)酵劑及其制備方法、悠久而底蘊(yùn)深厚的發(fā)酵工藝、復(fù)雜而協(xié)調(diào)的酒體風(fēng)味是世界其他蒸餾酒無法比擬的。中國白酒分為四大基礎(chǔ)香型——濃香、醬香、清香、米香，之后通過不斷的工藝融合和技術(shù)創(chuàng)新，以此四大香型為基礎(chǔ)又逐漸形成了芝麻香、兼香、鳳型、特型、老白干、豉香等共計十二大香型。其中，以茅臺為代表的醬香型白酒因其獨(dú)特的品質(zhì)而廣受國內(nèi)外消費(fèi)者的好評。同時，其復(fù)雜的“九次蒸煮，八次發(fā)酵，七次取酒”生產(chǎn)工序中所蘊(yùn)含的微生物代謝作用機(jī)理及物質(zhì)變化過程一直是業(yè)內(nèi)所研究的重點。

醬香白酒釀造工藝中高溫大曲制作、堆積發(fā)酵、窖內(nèi)糟醅發(fā)酵等過程實質(zhì)上等同于體系微生態(tài)的變化，此微生物區(qū)系與同體系內(nèi)的能量轉(zhuǎn)換及物質(zhì)傳遞緊密結(jié)合，從而發(fā)生變化。目前，現(xiàn)代生物前沿科技及人工智能已經(jīng)運(yùn)用于醬香白酒的生產(chǎn)過程研究，如微生物測序技術(shù)、微生物組學(xué)技術(shù)、代謝組學(xué)技術(shù)、生物傳感技術(shù)、人工智能調(diào)香技術(shù)等，這些技術(shù)的運(yùn)用逐步揭示了醬香白酒生產(chǎn)過程中的微生物演變及酒體風(fēng)味物質(zhì)組成。

1 醬香型白酒釀造工藝概述[1]

醬香型白酒風(fēng)味特點重在突出一“醬”字，業(yè)內(nèi)將其感官特征總結(jié)為“微黃透明、醬香突出、幽雅細(xì)膩、酒體醇厚、回味悠長、空杯留香持久”。這幾個字凝結(jié)的是無數(shù)代釀酒工作者的心血，傳承的是華夏“醬酒”的精髓之處。醬香型白酒的生產(chǎn)工藝的特點為“四高兩長，一大一多”，即采用高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、生產(chǎn)周期長、貯存時間長、大用曲量和多輪次發(fā)酵。這樣的工藝使得醬香型酒的香型和風(fēng)格與我國其他白酒迥然不同。關(guān)鍵工序見圖1。

圖1 醬香白酒生產(chǎn)部分關(guān)鍵工序圖示

糟醅高溫堆積的過程實質(zhì)是富集各種有益微生物，淘汰一部分雜菌，由此進(jìn)入多輪次的發(fā)酵，產(chǎn)酒的同時也生成多種風(fēng)味物質(zhì)，再經(jīng)高溫餾酒工序，使得酒精蒸出的同時也將發(fā)酵過程中所生成的高沸點、水溶性的醬香物質(zhì)（如酸、醇、氨基酸等）富集于酒液中，形成酒體醬香風(fēng)味。基酒通過長時間的貯存，再經(jīng)勾兌后貯存一段時間便可作為成品酒包裝出廠。醬香酒獨(dú)特的生產(chǎn)工藝造就其獨(dú)樹一幟的品質(zhì)，離開這基本工藝就釀不出高品質(zhì)的醬香酒，實質(zhì)是對工藝的研究，這樣才能保證研究內(nèi)容及成果和實際相符。

2 醬香酒功能微生物研究概況

2.1 醬香酒酒曲微生物類群研究

通過查閱文獻(xiàn)[2-12]，比對醬香高溫大曲、濃香中溫大曲、清香低溫大曲中微生物多樣性，見表1。

從文獻(xiàn)報道可看出[2-12]，醬香高溫大曲中芽孢桿菌種類較多，而正是由于高溫工藝，使得部分真菌無法有效繁殖富集；濃香中溫大曲中芽孢桿菌明顯沒有醬香大曲的多，但霉菌及酵母的數(shù)量比醬香大曲多，種類也更為豐富，這是因為其制曲溫度較低，適合真菌的繁殖富集；清香型低溫大曲中微生物種類相對前兩者要少。3種不同香型白酒釀造中有些微生物是共有的。據(jù)報道[13]，細(xì)菌、酵母、霉菌在糖化、產(chǎn)酒、酒質(zhì)等方面均具有明顯的相互作用，并且以三者為基礎(chǔ)制成微生物菌劑應(yīng)用于實際生產(chǎn)，在出酒率和酒體風(fēng)味物質(zhì)上都有顯著的提高。此類研究揭示著中國白酒各香型間是具有相互聯(lián)系的，而微生物的共性研究可以為探索相互間的關(guān)系提供路徑。

表1 不同香型大曲中微生物多樣性比較

2.2 醬香白酒釀造過程中的細(xì)菌

中國傳統(tǒng)白酒的生產(chǎn)是處于開放式的環(huán)境，環(huán)境微生物對釀酒的影響至關(guān)重要，細(xì)菌在中國白酒的釀造中扮演著重要的角色，從產(chǎn)香、生香作用上來說，細(xì)菌對醬香白酒的釀造尤為重要，比如產(chǎn)酯香功能細(xì)菌可明顯提高酒醅的蛋白酶活力、氨態(tài)氮含量和酯化力[14]。以茅臺成品大曲為例，其中90%的微生物為細(xì)菌，數(shù)量可以達(dá)到107個/g曲[15]，所以其又被稱為“細(xì)菌曲”[16]。細(xì)菌廣泛存在于醬香白酒制曲、堆積、酒醅發(fā)酵等工藝過程中，主要以芽孢桿菌屬、乳酸菌屬、醋酸菌屬、梭菌屬等為主[17]。醬香高溫大曲因制曲溫度高達(dá)60℃，所以帶入的細(xì)菌亦為嗜熱細(xì)菌[18]。此部分細(xì)菌活躍于高溫大曲中，產(chǎn)生豐富的呈香前體物質(zhì)，以大曲作為媒介帶入到醬香白酒的整個釀造階段，后經(jīng)堆積發(fā)酵、窖池發(fā)酵，再次富集培養(yǎng)環(huán)境中更多的微生物，于體系中形成醬香酒獨(dú)特的微生物菌群結(jié)構(gòu)[19]。有研究報道[20]，大曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性高于堆積酒醅，而且對于高溫堆積工序，同一輪次中變化趨勢為：堆積中期＞堆積后期＞堆積前期。經(jīng)研究證明[21]，芽孢桿菌是醬香白酒生產(chǎn)中的主要產(chǎn)香功能細(xì)菌，它可分泌豐富的酶系，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等，作用于小麥、高粱等釀酒原料進(jìn)而產(chǎn)生豐富的氨基酸、糖類等物質(zhì)，再通過后續(xù)系列的生化反應(yīng)生成具特殊風(fēng)味的芳香類化合物。另據(jù)研究報道[22-24]，醬香高溫大曲制曲過程中多種游離氨基酸可發(fā)生美拉德反應(yīng)，促進(jìn)醬香風(fēng)味的形成，而芽孢桿菌推動了此反應(yīng)的進(jìn)行。

2.2.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化研究

研究醬香白酒生產(chǎn)過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及種類數(shù)量上的變化，以及與環(huán)境之間的內(nèi)在聯(lián)系，可為揭示醬香風(fēng)味形成機(jī)理提供理論指導(dǎo)。細(xì)菌廣泛存在于制曲及其制酒過程中，王曉丹等[26]對3種不同醬香高溫大曲中細(xì)菌群落組成進(jìn)行研究，其中地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)數(shù)量在芽孢桿菌中遠(yuǎn)高于其他細(xì)菌。在楊代永的研究中也證實醬香高溫大曲中含有豐富的地衣芽孢桿菌，其芽孢桿菌總數(shù)可達(dá)到2.118×107cfu/g曲[2]，并且多數(shù)為適宜60～65℃下繁殖生長的嗜熱菌。唐玉明等[25]對醬香白酒輪次生產(chǎn)過程進(jìn)行跟蹤研究，結(jié)果表明，好氧細(xì)菌數(shù)量發(fā)酵初期可最高達(dá)107個/g糟，發(fā)酵中期減少到105個/g糟，其中，好氧芽孢桿菌基本維持在104～105個/g糟，兼性厭氧菌及其芽孢桿菌在入窖初期數(shù)量略有降低，中期出現(xiàn)低谷，整個發(fā)酵過程平均維持為104個/g糟，這與楊代永總結(jié)的細(xì)菌在制曲過程中符合“前期達(dá)到峰值，中期回落，后期回升”的結(jié)論一致。

細(xì)菌與多種醬香前體物質(zhì)的生成之間具有緊密聯(lián)系，有研究表明[27]，乳酸菌與乳酸、乙酸等酸類物質(zhì)的生成存在顯著關(guān)聯(lián)，芽孢桿菌與酸類物質(zhì)、含氮化合物之間相關(guān)性顯著。關(guān)于此，江南大學(xué)作了深入的研究，徐巖[13]報道，醬香型白酒中檢測出了高含量的四甲基吡嗪，并通過實際生產(chǎn)運(yùn)用證實其可增強(qiáng)酒體“空杯留香”的特點。據(jù)報道[15]，醬香大曲中產(chǎn)酶細(xì)菌主要集中為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌等，其中枯草芽孢桿菌具有明顯的蛋白酶活力，并部分具有淀粉酶活。也有研究報道已證實，四甲基吡嗪并非是美拉德反應(yīng)生成的[29]，故總結(jié)以上研究結(jié)論，結(jié)合四甲基吡嗪可增強(qiáng)醬香酒體“空杯留香”特點及枯草芽孢桿菌可高產(chǎn)四甲基吡嗪的特型，推測枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶特性對于生成醬香白酒特征風(fēng)味物質(zhì)——四甲基吡嗪具有一定作用。

醬香白酒釀制過程中細(xì)菌的群落變化還與周圍環(huán)境因素相關(guān)。黃治國等[28]利用PCR-DGGE技術(shù)研究不同地域醬香型酒醅中優(yōu)勢細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，研究表明，不同細(xì)菌群間存在著共生或競爭的關(guān)系，因地域環(huán)境、工藝、水質(zhì)等的不同，酒醅細(xì)菌群落多樣性及相似性均不同。亦有報道[22]，不同區(qū)域醬香型白酒窖底泥的細(xì)菌多樣性主要受pH值、速效鉀、水分的影響，且在一定范圍內(nèi)與速效鉀呈負(fù)相關(guān)，與pH值和水分含量呈正相關(guān)。因此，不同區(qū)域內(nèi)所形成的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也不盡相同，這也是醬酒生產(chǎn)離不開特定條件環(huán)境的重要原因之一。

2.2.2 細(xì)菌產(chǎn)酶特性研究

白酒釀造過程中酶類起到分解原料、促進(jìn)體系內(nèi)生化反應(yīng)的作用。醬香白酒生產(chǎn)過程中可監(jiān)測到的酶類主要為酸性、中性蛋白酶，以及淀粉酶、酯化酶、纖維素酶、果膠酶等，其中大多數(shù)酶類可由細(xì)菌分泌獲得[30]。因此，醬香白酒釀造過程中體系內(nèi)酶系的變化及作用機(jī)制一直是業(yè)內(nèi)的研究熱點，其中細(xì)菌產(chǎn)酶功能研究是一大重點?？莶菅挎邨U菌具有較強(qiáng)蛋白酶活，地衣芽孢桿菌具有酸性蛋白酶活，且在50℃下還具有較高的酶活，蠟狀芽孢桿菌具有較高的內(nèi)切纖維素酶活力和外切纖維素酶活力，并且亦耐高溫[31-32]。另有報道[33]，微生物纖溶酶有可能作為預(yù)防血栓栓塞類疾病的配方使用，并且枯草芽孢桿菌可以分泌有效的纖溶酶，林芬等[34]通過發(fā)酵聞香及酪蛋白分解酶活測定，從不同酒廠的酒曲、酒糟、窖泥中分離篩選出20株產(chǎn)香好、蛋白酶活高的細(xì)菌，進(jìn)一步測定了其中9株有較高的纖溶酶活力，其中最高可達(dá)1479.11 U/mL。總之，對細(xì)菌分泌的酶類及其在體系中的作用機(jī)理進(jìn)行探討研究，不僅有助于分析醬香風(fēng)味物質(zhì)成分，還利于使用基因工程技術(shù)選育優(yōu)良產(chǎn)酶功能菌株，為醬香白酒的規(guī)模生產(chǎn)和提高優(yōu)級基酒出酒率提供科學(xué)指導(dǎo)[30]。另外也可以從其他學(xué)科中獲取信息，通過深入挖掘產(chǎn)醬香細(xì)菌中可用于生物酶制劑、醫(yī)療、保健食品等行業(yè)的功能，從而創(chuàng)造新的科研運(yùn)用價值。

2.2.3 細(xì)菌強(qiáng)化大曲研究

眾多研究表明，芽孢桿菌是醬香風(fēng)味形成的關(guān)鍵功能微生物，因此，利用細(xì)菌純培養(yǎng)技術(shù)，將1株或多株產(chǎn)香芽孢桿菌移殖入制曲過程中進(jìn)行培養(yǎng)，以此起到強(qiáng)化大曲的作用，借以豐富及提高后續(xù)發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量。對此，業(yè)內(nèi)不斷對細(xì)菌強(qiáng)化大曲進(jìn)行相關(guān)研究。趙希玉等[79]利用從茅臺酒釀造微生物中篩選出的6株產(chǎn)醬香細(xì)菌制成細(xì)菌曲，并加入到制酒過程中，試驗結(jié)果表明，加入細(xì)菌曲的產(chǎn)酒質(zhì)量明顯有所提高。楊濤等[35]將醬香大曲中所分離到的地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等按一定比例混合制成三級種子液，后在拌料階段加入到制曲過程，試驗所得強(qiáng)化大曲的液化力、蛋白質(zhì)水解力均有明顯升高，并且大曲中游離氨基酸含量有所提升，運(yùn)用到釀酒階段時，糟醅的各項理化指標(biāo)均有提升，釀制酒液的品質(zhì)優(yōu)良。孟天毅等[36]對本公司生產(chǎn)車間的強(qiáng)化高溫大曲進(jìn)行了分析研究，結(jié)果表明，強(qiáng)化大曲的微生物構(gòu)成與成品曲基本一致，且強(qiáng)化大曲的醬香風(fēng)味更加突出，而成品曲則是曲香突出；強(qiáng)化大曲產(chǎn)酒醬香更加濃郁、酒體爽凈，而成品曲則顯得更加豐滿、醇厚。

上述研究證實，醬香大曲中確實存在生產(chǎn)中起到主導(dǎo)作用的細(xì)菌，將這些具重要功能的細(xì)菌分離，并通過一定工序植入大曲中培養(yǎng)富集，確實可以起到強(qiáng)化大曲的作用，進(jìn)而達(dá)到提高產(chǎn)酒質(zhì)量的效果。不同添加菌株及不同工藝下所生產(chǎn)的強(qiáng)化大曲，對傳統(tǒng)醬香白酒釀造的“強(qiáng)化點”及“強(qiáng)化程度”均有所不同，對酒質(zhì)的影響也不一樣[37]。對強(qiáng)化大曲的研究及實踐運(yùn)用，可真正實現(xiàn)科研與生產(chǎn)的接軌，讓科研成果能夠為生產(chǎn)服務(wù)，降低能耗、提高產(chǎn)量，對實現(xiàn)行業(yè)集約型生產(chǎn)意義重大。

2.3 醬香酒釀造過程中的酵母菌

酵母菌在日常生活中隨處可見，酸奶、面包等發(fā)酵性食品的生產(chǎn)過程中均是酵母菌在起著主導(dǎo)作用，同樣，酵母在釀酒過程中是不可或缺的。在醬香大曲制曲過程的高溫環(huán)境下，酵母菌無法生存，所以整個制曲過程無法富集周邊環(huán)境內(nèi)酵母菌[38]。酵母菌的帶入及富集主要是在堆積發(fā)酵過程中，酒醅在開放式的生產(chǎn)環(huán)境下與空氣接觸，酵母菌通過空氣及生產(chǎn)器具作為媒介進(jìn)入酒醅中，再通過不斷繁殖，成為體系內(nèi)除細(xì)菌、霉菌外的主要功能微生物[40]。酵母菌可于堆積發(fā)酵酒醅中大量分離得到，主要有球擬酵母、假絲酵母、漢遜酵母等，是參與發(fā)酵產(chǎn)酒產(chǎn)香的重要微生物[39]。按功能的差別，醬香白酒生產(chǎn)中的酵母菌可分為釀酒酵母和生香酵母，前者有較強(qiáng)的產(chǎn)酒精能力，后者則是可以酯化酸類、醇類等物質(zhì)，產(chǎn)生以乙酸乙酯為主要酯類的風(fēng)味物質(zhì)，提升醬香白酒品質(zhì)[19]。

2.3.1 酵母菌種類及數(shù)量變化研究

不單對于醬香白酒，對于其他香型白酒來說，酵母菌都在出酒率、產(chǎn)香、酒體品質(zhì)等方面展現(xiàn)出其重要的作用[41]。因此，研究酵母菌在醬香白酒生產(chǎn)中的群落結(jié)構(gòu)變化及相應(yīng)的生化反應(yīng)機(jī)制，對于揭示醬香白酒釀造過程中科學(xué)內(nèi)涵具有重大意義。唐玉明[25]及印璇等[42]的研究均證實，在窖池發(fā)酵的過程中，上層糟中酵母數(shù)量一直略高于中、下層，且酵母菌的數(shù)量隨著時間的延長而呈現(xiàn)下降的趨勢。兩者的研究均說明窖池發(fā)酵時已經(jīng)不再是酵母的繁殖及富集階段，而制曲階段的高溫環(huán)境不利于酵母菌的生長繁殖，故推測酵母菌主要仍是通過高溫堆積階段帶入。

有研究曾對醬酒生產(chǎn)過程中的酵母菌變化作了較為全面的研究[43]，結(jié)果表明，高溫大曲中可以檢測出極其少量的酵母菌，主要為漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)和扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)2種；而在高溫堆積發(fā)酵階段，酵母數(shù)量則穩(wěn)定維持在106～107cfu/g，酒醅中包含絲孢酵母(Trichosporon coremiiforme)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、庫得畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)、粉狀畢赤氏酵母(Pichia farinosa var.farinose)等共12個種，整個生產(chǎn)工序中酒質(zhì)好的第4輪、第5輪次酒醅中，酵母數(shù)量明顯多于后續(xù)的輪次；大部分酵母菌具有產(chǎn)多元醇的能力，并且還可以代謝出苯乙醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙基苯酚、芳樟醇等物質(zhì)。由此可以看出，酵母菌幾乎存在于釀酒的各個工序中，酒醅中包含的酵母菌是最豐富的，并且可以代謝產(chǎn)生多種醇類化合物，對醬香白酒的呈香具有推動作用。

2.3.2 酵母菌在發(fā)酵過程中生長特性研究

酵母菌作為釀酒中的必不可少的成員之一，其生長特性、環(huán)境適應(yīng)性，以及與體系中其他微生物共生關(guān)系的研究一直是業(yè)內(nèi)熱點。已有多篇文獻(xiàn)報道證實酵母菌具有良好的耐高溫、耐受pH值、耐酒精濃度的特性[44-45，47]，也有多種酵母菌被分離，并證實其具有產(chǎn)酒及產(chǎn)多種化合物功能。其中莊孝杰等[44]從醬香酒醅中篩選得到1株性狀優(yōu)良的拜耳接合酵母(Z.bailii15)，該菌酒精產(chǎn)量可達(dá)到33.58 g/L，并且與模式菌株相比較可多產(chǎn)十二醇、月桂酸、辛酸乙酯、苯乙酮、4-叔丁基苯酚等多種物質(zhì)，且同酒醅分離的地衣芽孢桿菌在37℃條件下可抑制其生長繁殖。路曉偉等[45]從醬香酒醅中分離篩選出1株性能優(yōu)異的釀酒酵母MT1，該菌乙醇轉(zhuǎn)化率也要高于其他菌株，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)物鑒定，一些風(fēng)味物質(zhì)成分如2,3-二氫苯并呋喃、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、法尼醇、橙花叔醇、乙偶姻和大馬酮等都有在MT1中檢測出，并且與對照菌株相比，有少部分物質(zhì)是只有該菌才代謝產(chǎn)生。以上報道均體現(xiàn)出酵母菌高產(chǎn)酒精的特性，并且從所產(chǎn)物質(zhì)種類來看包含酸類、酚類、芳香族、酮類多種，體現(xiàn)出酵母在產(chǎn)香方面也具有一定的作用。

釀酒酵母作為酵母菌的模式菌株，在研究酵母菌與其他微生物共生關(guān)系時都將其列為研究對象。孟醒[46]研究了釀酒酵母與地衣芽孢桿菌的相互作用分子機(jī)制，研究表明，釀酒酵母在低pH值環(huán)境下可抑制地衣芽孢桿菌的生長。白夢洋等[47]研究了釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae，Sc）和畢赤酵母菌（Pichia fabianii，Pf）之間的相互影響，混合菌條件下，后者對前者有明顯抑制作用，而Pf細(xì)胞代謝產(chǎn)生的亞油酸和亞麻酸可能是抑制Sc生長的因素。

從以上研究可以看出，醬香白酒生產(chǎn)過程中酵母菌的特性各有差異，但都具有一定的耐高溫、耐酸、耐酒精濃度的特性，這與醬香白酒生產(chǎn)中體系溫度較高，酒醅具一定酸度、酒精濃度較高相關(guān)，正是因為這些工藝條件，在漫長的傳統(tǒng)工藝釀造過程中馴化了周圍的酵母菌，使之適應(yīng)醬香白酒的生產(chǎn)。酵母菌在體系中會與其他微生物產(chǎn)生拮抗作用，其中有些作用利于反應(yīng)正向進(jìn)行。酵母菌的發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)較為豐富，多篇研究報道也證實了這一點[15，19，41]，并且通過某些基因的敲除，可使其代謝產(chǎn)物含量和種類達(dá)到可控。

2.3.3 酵母菌在各輪次中的變化研究

醬香白酒生產(chǎn)過程各個輪次的產(chǎn)酒情況均不一樣，工藝中有“掐頭去尾”的說法。其中，中間輪次的產(chǎn)酒酒質(zhì)明顯優(yōu)于后面輪次的，結(jié)合其生產(chǎn)工藝中的多輪次固態(tài)發(fā)酵，研究其中微生物特別是細(xì)菌、酵母菌等的種群結(jié)構(gòu)變化，對于揭示各輪次酒質(zhì)差別的深層次原因具有實際參考價值。邵明凱等[41]利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)和實時熒光定量PCR(RT-q PCR)技術(shù)，對醬香白酒生產(chǎn)過程中產(chǎn)量較高、酒質(zhì)優(yōu)良的第5輪次和較差的第7輪次工藝中酒醅進(jìn)行了酵母群落結(jié)構(gòu)的分析研究，并對風(fēng)味成分進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，第5輪和第7輪中分離出的酵母優(yōu)勢菌種有差異；第7輪次發(fā)酵后期發(fā)現(xiàn)酵母菌有明顯衰亡的現(xiàn)象，第5輪次則相對穩(wěn)定，且后者酵母含量是前者的2～5倍，乙醇含量也要高出2倍多；第5輪次酒醅發(fā)酵產(chǎn)物中酯類高于第7輪次，而有機(jī)酸和雜醇油含量低于第7輪次。孫劍秋等[48]采集北大倉酒廠生產(chǎn)中不同階段的發(fā)酵窖池酒醅，分離獲得大量酵母菌，再基于26S rDNA D1/D2區(qū)域的堿基序列準(zhǔn)確鑒定酒醅中的酵母菌，從而研究其中酵母菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，酵母菌數(shù)量在釀造過程中遵循著“升高-降低-升高-降低”的規(guī)律，各個輪次的升降幅度及速度不同，且各輪次中酵母菌的組成及分布具有相似之處。吳徐建[49]追蹤研究了醬香型白酒第2輪至第7輪次釀造體系中酵母菌群落結(jié)構(gòu)，共鑒定出16個酵母種屬，結(jié)果表明，不同輪次起始時酵母含量相差可達(dá)到452倍，但發(fā)酵結(jié)束時差別縮小至10倍左右；窖池發(fā)酵中上層、中層、下層酒醅酵母類別基本一致，主要為Z.bailii、Schizosaccharomyces pombe、S.Cerevisiae，這些菌株對醬香白酒風(fēng)格形成具有一定作用。從以上研究報道可以看出，酵母菌在各輪次發(fā)酵過程中數(shù)量上均有所差異，因地而異，有的只有幾倍的差距，有的卻可以高達(dá)幾百倍的差異。共同點是酵母菌都會隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸衰亡，其在產(chǎn)乙醇、產(chǎn)香方面的作用突出，特別是在中間輪次的發(fā)酵過程中尤為明顯。

2.4 醬香酒釀造過程中的霉菌

醬香白酒釀造過程中可分離出的主要真菌，其一為酵母菌，其二便是霉菌。霉菌的主要功能主要是分泌糖化酶、液化酶及蛋白酶，對分解釀酒原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)具有積極的推動作用，使得整個反應(yīng)體系中糖類及氨基酸含量升高，可為其他微生物的代謝提供基礎(chǔ)物質(zhì)，亦為后續(xù)的酒體風(fēng)味形成奠定基礎(chǔ)[50，21]。在醬香大曲制曲過程中，由于水分含量少、高溫、缺氧，不利于霉菌的生長富集，所以其中檢出的霉菌較少[40]。霉菌的主要來源為空氣、場地、原輔料、母曲及人體，它們的數(shù)量可達(dá)6.446×106cfu/g曲[2]。業(yè)內(nèi)對于霉菌的研究，主要集中在其酶活性能、菌群結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)組學(xué)、發(fā)酵性能等方面，同時還認(rèn)為霉菌具有調(diào)節(jié)糖化、發(fā)酵和生香的作用，對醬香白酒釀造過程中霉菌多樣性、生長代謝過程及其發(fā)酵風(fēng)味產(chǎn)物的研究，可以為揭示醬香風(fēng)味形成機(jī)理提供可行途徑。

2.4.1 霉菌在釀造過程中種類的研究

霉菌的大量富集是在大曲的儲存及堆積發(fā)酵的過程中，其數(shù)量及類群在體系中占比較大[17]，并且以毛霉、曲霉、青霉居多[15]，有報道稱茅臺大曲中可分離出的霉菌就達(dá)到40多種[51]。有研究報道了南方、北方醬香高溫大曲中霉菌含量的差異，南方高溫大曲中霉菌數(shù)量高于北方100倍[52]，推斷這是由于南北氣候、溫差、地貌等環(huán)境因素的不同而導(dǎo)致的，也是南北方所釀造的醬香白酒品質(zhì)具有差異的一大因素。據(jù)陳筆[53]的分析報道，在高溫堆積階段霉菌是呈上升趨勢的，從堆積初始的3.4×103cfu/g增加到第3天的1.28×104cfu/g，后一直下降至發(fā)酵結(jié)束時不到1.0×103cfu/g，同樣孫劍秋的研究中也證實了窖池內(nèi)部霉菌數(shù)量從發(fā)酵初期開始即急劇下降，與同為真菌的酵母菌變化相似[48]。亦有研究報道[54]，醬香大曲制作過程中在儲存前1個月內(nèi)霉菌呈上升趨勢，最大值可達(dá)到4.5×105cfu/g，后隨著儲存時間的延長逐漸下降。有報道稱[53]，A.oryzae(米曲霉)和P.variotii(擬青霉)是發(fā)酵過程中的優(yōu)勢霉菌，具有較高的糖化酶和α-淀粉酶酶活，將米曲霉和釀酒酵母在不同條件下混合發(fā)酵，能夠提高體系的酯類、酸類、醇類、醛酮類等風(fēng)味物質(zhì)的濃度，且酒體中重要的風(fēng)味成分化合物乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、3-甲基-丁醇、乙酸等有較明顯的提高。據(jù)此可以看出，醬香酒大曲儲存及酒醅高溫堆積階段是霉菌重要的富集過程，霉菌和酵母之間可能存在相互促進(jìn)物質(zhì)催化反應(yīng)的機(jī)制，使得產(chǎn)酒組分得以豐富提高。

2.4.2 霉菌產(chǎn)酶特性研究

醬香酒風(fēng)味物質(zhì)的形成與體系內(nèi)酶系的組成含量密不可分，生產(chǎn)過程中原料本身所帶有的酶是非常少的，大多數(shù)都是靠體系微生物分泌而來，而霉菌本身可以產(chǎn)生多種酶類，據(jù)報道，醬香酒醅中分離的霉菌以紅曲、毛霉、地霉、擬青霉等為主，其中曲霉和青霉產(chǎn)生的功能酶類較多，種類也較為豐富[48]。HEIN I等[55]對青霉的分泌酶系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示青霉可以產(chǎn)聚糖酶系，這使得釀酒原料中的木質(zhì)纖維可以被降解，對于高效利用原料，提高出酒率具有一定的促進(jìn)作用。班世棟[56]對不同樣品曲儲藏期的酶活進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)各種水解酶在大曲儲藏過程中的變化趨勢不同；分離出了19株霉菌，其中構(gòu)巢曲霉、分枝犁頭霉、離生青霉和溜曲霉同時產(chǎn)生的多種酶活都較高。黃永光[57]從醬香白酒酒醅中獲得了1株高產(chǎn)糖化酶和蛋白酶的功能曲霉，其分泌酸性蛋白酶組分AP2和AP3，將AP3運(yùn)用到發(fā)酵過程中，可使酒醅風(fēng)味物質(zhì)含量提高183.94%，醇類、酸類、酯類和芳香族化合物提升明顯，證實了霉菌產(chǎn)蛋白酶對風(fēng)味物質(zhì)的形成具有關(guān)鍵作用。有研究表明[58]，霉菌可代謝產(chǎn)生檸檬酸、草酸等有機(jī)酸，曲霉代謝可產(chǎn)生具抑制癌細(xì)胞活性的壺角甾醇，所以推測霉菌對醬香白酒風(fēng)味形成及保健功能具有一定作用。另有報道稱[51]，霉菌和酵母間在產(chǎn)酶方面有不同的促進(jìn)或抑制作用，相同的2株菌在不同的環(huán)境條件下也可能出現(xiàn)共生或競爭2種不同結(jié)果，這也反映了在釀造過程中微生物之間相互作用的復(fù)雜性。

以上研究表明，霉菌在醬香白酒釀造過程中分泌糖化酶、蛋白酶等多種酶類，發(fā)揮糖化作用的同時也在促進(jìn)多種風(fēng)味物質(zhì)的形成，為醬香風(fēng)味的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。同時霉菌還可以在一定程度上利用釀酒原料中不易被分解的纖維素，在提高原料使用率方面可起到一定作用。

3 醬香白酒釀造過程中微生物代謝產(chǎn)物研究

3.1 酒曲微生物及其生物轉(zhuǎn)化過程

醬香白酒高溫大曲是個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。在酒曲品質(zhì)形成過程中，酒曲微生物與酒曲原料轉(zhuǎn)化、培曲環(huán)境之間存在著復(fù)雜的生態(tài)學(xué)關(guān)系，詳見圖2。

目前，制作醬香高溫大曲的原料主要是小麥，小麥中主要含有蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素，微生物的作用即是分解此3種組分，進(jìn)而通過各種生化反應(yīng)生成風(fēng)味物質(zhì)。在大曲中酵母菌分泌的蛋白酶均為酸性蛋白質(zhì)，特別是那些以單分子氨基酸為終產(chǎn)物的蛋白酶。這類酶只有在酵母菌溶解后才會表現(xiàn)出活性，對白酒的風(fēng)味形成具有重要意義。而酵母菌自溶后釋放出來的營養(yǎng)成分又可作為其他微生物生長的養(yǎng)料[59]。曲霉屬如米曲霉等分泌的蛋白酶和細(xì)胞溶解酶可將不溶性的大豆和小麥成分分解成水溶性的多肽、糖、游離氨基酸等物質(zhì)[60]。在毛霉和根霉等分泌的淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶的作用下，淀粉轉(zhuǎn)化為低分子糖類、少量乙醇等物質(zhì)[61-62]。木霉屬參與纖維素和淀粉降解，紅曲霉屬參與酯質(zhì)合成，根霉屬還參與揮發(fā)性物質(zhì)合成[62]。甘露醇是以甘露糖為基質(zhì)，在霉菌分泌的甘露醇脫氫酶作用下縮合而成，也可以果糖為基質(zhì)，在甘露醇脫氫酶作用下縮合而成[63]。甘露醇是一種生物滲透保護(hù)劑，對大曲具有保護(hù)作用，同時還可作為儲備碳源或是活性氧清除劑[64]。在酒曲發(fā)酵過程中，含硫氨基酸經(jīng)降解、縮合生成含硫化合物如香葉基丙酮、大馬刺酮、千內(nèi)酯等，對白酒風(fēng)味形成具有重要影響[65]。

圖2 酒曲微生物、原料轉(zhuǎn)化以及發(fā)酵產(chǎn)物之間的生態(tài)學(xué)過程

3.2 醬香白酒釀造過程中微生物與醬酒風(fēng)味的關(guān)系

醬香白酒中特征風(fēng)味物質(zhì)的研究在近年來得到業(yè)內(nèi)的重視，但是由于其復(fù)雜性，一直沒有定論。于此，業(yè)內(nèi)主要有4-乙基愈創(chuàng)木酚、吡嗪類化合物、吡喃類和吡喃類衍生物、高沸點酸類等幾種假說[40]。有研究報道[39]，經(jīng)高溫堆積與不堆積的酒醅在酯類、醇類、酸類物質(zhì)上含量相差較大，高溫堆積的酒醅各物質(zhì)含量均比不堆積的高出很多，這也證明了高溫堆積工序在整個醬香白酒釀造工藝中的重要地位；不堆積及堆積不好的酒醅，無法為后續(xù)過程提供豐富的微生物區(qū)系、酶系及風(fēng)味前體物質(zhì)；醬香酒中雜環(huán)類物質(zhì)含量比其他香型要高。醬香大曲中酸性組分所占比例最大（90%左右），且也具有較高含量的吡嗪類、酚類和芳香化合物[66]，而堆積酒醅中醇類及酯類均有較大占比[67]。

3.2.1 細(xì)菌產(chǎn)香研究

如前所述，醬香高溫大曲中芽孢桿菌的數(shù)量占較大比例，并且必須要在高溫制曲環(huán)境下才能富集這些嗜熱細(xì)菌。普遍認(rèn)為，芽孢桿菌是產(chǎn)醬香風(fēng)味的主要功能細(xì)菌，比如有報道稱醬香白酒中具有較高含量的地衣素，該物質(zhì)在保留醬香白酒酒體中相關(guān)風(fēng)味物質(zhì)方面起到重要作用，產(chǎn)生該類物質(zhì)主要即為芽孢桿菌[71]，所以對醬香酒釀造過程中細(xì)菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物的研究也是業(yè)內(nèi)熱點。武思齊[68]對實驗中所篩選的產(chǎn)醬香風(fēng)味芽孢桿菌發(fā)酵風(fēng)味產(chǎn)物進(jìn)行研究，結(jié)果表明，隨著溫度的升高，其發(fā)酵產(chǎn)物種類及含量均有所提升；經(jīng)質(zhì)譜檢測出27種化合物，包括醛、醇、吡嗪、高級烷烴等，其中含量較高的是苯乙醛、吲哚、糠醛等。張榮[69-70]從醬香高溫大曲中分離鑒定出3株地衣芽孢桿菌，經(jīng)GC-MS分析其發(fā)酵液中揮發(fā)性組分，結(jié)果表明，乙偶姻、四甲基吡嗪和呋喃扭爾是這3株菌的特征風(fēng)味化合物，四甲基吡嗪是發(fā)酵后期由乙偶姻轉(zhuǎn)化而來的，且該物質(zhì)含量在55℃時比低溫時明顯升高，此高溫下發(fā)酵液醬香風(fēng)味也愈發(fā)明顯，將實驗菌株應(yīng)用于實際生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌數(shù)量明顯增加，頭段酒樣中芳香族類和吡嗪化合物的含量有了顯著提高，且產(chǎn)出酒液風(fēng)味較好。趙興秀等[71]從醬香高溫大曲中分離篩選出3株醬香風(fēng)味明顯的菌株，經(jīng)鑒定均為枯草芽孢桿菌，通過HS-SPME與GC-MS技術(shù)分析檢測，3株芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中吡嗪類及酮類物質(zhì)相對含量較高。羅建超等[72]從醬香高溫大曲中分離出芽孢桿菌104株，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等，產(chǎn)醬香優(yōu)良的有25株，能產(chǎn)二乙酰、乙偶姻等物質(zhì)。以上研究表明，醬香酒釀造過程中常見細(xì)菌為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等，所產(chǎn)物質(zhì)有醛、醇、吡嗪、烷烴類物質(zhì)等，不同的細(xì)菌所產(chǎn)物質(zhì)有所差異。醬香白酒釀造工藝離不開豐富的細(xì)菌群落，以芽孢桿菌為主的細(xì)菌可作用于原料，生成可促進(jìn)醬香風(fēng)味形成的物質(zhì)，為酒體的典型風(fēng)格塑造提供物質(zhì)保證。

3.2.2 真菌產(chǎn)香研究

真菌在釀酒工藝過程中也是重要的一類微生物，主要為酵母和霉菌，其在釀造工藝中除了具有糖化、酒化作用，還可以生成一定量的酯類、醛類、雜環(huán)類物質(zhì)，同樣為醬香風(fēng)格的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。蔡雪梅等[19]從醬香型白酒釀造酒糟中篩選出7株高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌株，其產(chǎn)物涉及醇類、酯類、酸類、吡嗪類、酮類等多種物質(zhì)，最后確定其中1株產(chǎn)醬香風(fēng)味的酵母為畢赤酵母。路曉偉等[45]從醬香白酒釀造環(huán)境中篩選出1株釀酒酵母，其可以利用多種糖類發(fā)酵產(chǎn)乙醇，產(chǎn)物中以苯乙醇、法尼醇、橙花叔醇、乙偶姻和大馬酮的含量較高。凌杰[73]研究了地衣芽孢桿菌及釀酒酵母之間的相互關(guān)系，研究表明，地衣芽孢桿菌可促進(jìn)釀酒酵母產(chǎn)2-甲基丁酸和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等風(fēng)味物質(zhì)，而4-乙烯基愈創(chuàng)木酚正是醬香風(fēng)味中的關(guān)鍵組分。韓瑩等[74]從茅臺大曲中分離篩選出1株毛霉，GC-MS分析其發(fā)酵主要代謝產(chǎn)物為亞油酸乙酯和油酸乙酯，這兩種成分是茅臺酒空杯留香的主要成分。鄧皖玉等[75]從高溫大曲中分離篩選出3株霉菌，此3株霉菌均會產(chǎn)生少量的胺類物質(zhì)，并且會產(chǎn)生乙硫醇、二甲基硫、二硫二甲基等硫化物，這些物質(zhì)少量時可以促進(jìn)醬香風(fēng)味的形成，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為含硫的雜環(huán)類物質(zhì)。多數(shù)霉菌可以代謝產(chǎn)生色素，使得曲心、曲表等位置體現(xiàn)出不同的顏色，如黃曲霉可以產(chǎn)黃色素，黑曲霉可以產(chǎn)黑色素等[51]。以上研究表明，真菌不僅可以產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，其亦可以催化體系內(nèi)的某些反應(yīng)促使其他化合物的生成。在醬香白酒釀造過程龐雜的微生物區(qū)系中，細(xì)菌、酵母、霉菌之間存在著一定的相互促進(jìn)、相互拮抗的作用，在高溫、高酒精度、低pH值的環(huán)境下不斷的馴化，最終也會使得一些真菌具有一定的耐受性，從而改變其代謝產(chǎn)物[58]。微生物代謝產(chǎn)物最終進(jìn)入生化反應(yīng)中進(jìn)行復(fù)雜的物質(zhì)轉(zhuǎn)化及能量轉(zhuǎn)換，從而完成整個釀造過程。

4 展望

“多微共酵”是醬香白酒釀造過程中的顯著特點。醬香白酒中的各香味成分含量通常為1/10萬～1/100萬,甚至是千萬分之幾,其余的是乙醇及水，香味即是靠這些含量極微的化合物而體現(xiàn)出來[77]。從大曲的制備到酒醅發(fā)酵的過程中，相關(guān)微生物區(qū)

系內(nèi)部發(fā)生著復(fù)雜的協(xié)同代謝作用，將原料轉(zhuǎn)化為繁多的特殊化合物。因此對呈香物質(zhì)的研究要從醬香工藝中的微生物代謝入手，重點是要了解其中的發(fā)酵機(jī)理及其相互之間的交叉作用，解析其中的微生態(tài)作用過程。后再進(jìn)一步以基因工程手段融合或選育優(yōu)良性狀菌株，將其運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)中，在提高醬香品質(zhì)、促進(jìn)原料轉(zhuǎn)化、提高出酒率方面進(jìn)行重點研究，這不僅可為醬香酒生產(chǎn)中復(fù)雜的生化反應(yīng)找到可靠的科學(xué)依據(jù)，對工藝的改進(jìn)創(chuàng)新也具有重要意義。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，業(yè)內(nèi)科研工作者可從微生物多樣性、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面逐步揭開醬香白酒釀造過程中微生物多樣性變化及其代謝產(chǎn)物的神秘面紗。