miR-125a靶向基因?qū)Ω伟┘?xì)胞類胰島素生長(zhǎng)因子-1及其受體抑制劑表達(dá)的影響

miR-125a靶向基因?qū)Ω伟┘?xì)胞類胰島素生長(zhǎng)因子-1及其受體抑制劑表達(dá)的影響

張日金

(安丘市人民醫(yī)院普外科，山東安丘262100)

摘要〔〕目的探討miR-125a靶向基因?qū)Ω伟┘?xì)胞類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)-1及其受體抑制劑鬼臼苦素(PPP)表達(dá)的影響。方法在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中接種Hep2細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，更換為乙二胺四乙酸(EDTA)溶液和胰蛋白酶的消化液消化，使全部細(xì)胞完全脫離瓶壁，于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),在孵箱中培養(yǎng)。構(gòu)建為重組質(zhì)粒pGenesil-miR-125a。轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞。篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hep2細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，檢測(cè)miR-125a對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用和IGF-1、PPP的水平。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,活細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05)。隨著細(xì)胞的增殖，兩組細(xì)胞的IGF-1陽(yáng)性率均降低，與實(shí)驗(yàn)組相比，對(duì)照組下降更為明顯(P<0.05)。對(duì)照組細(xì)胞PPP陽(yáng)性率未發(fā)生明顯變化(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞PPP陽(yáng)性率明顯升高(P<0.05)。結(jié)論miR-125a靶向基因能夠降低肝癌細(xì)胞類IGF-1水平，升高其受體抑制劑PPP的水平，抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

關(guān)鍵詞〔〕miR-125a；肝癌細(xì)胞；胰島素樣生長(zhǎng)因子；胰島素生長(zhǎng)因子受體抑制劑

中圖分類號(hào)〔〕R735.7〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：張日金(1971-),男,副主任醫(yī)師，主要從事肝膽胰腺腫瘤研究。

肝癌致死率最高的癌癥之一，研究表明〔1〕，miRNA 參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。其中一些miRNA在肝癌中和正常組織中的表達(dá)存在差異，這是由于miRNA 影響了肝癌的增殖。還有研究指出miRNA 可以作為腫瘤新的靶點(diǎn)，用于腫瘤的診斷和治療〔2〕。有學(xué)者在研究肝癌 miRNA的文獻(xiàn)中指出，miR-125a在肝癌組織中為表達(dá)量降低，其過(guò)量的表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡〔3〕，但是其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的研究卻未見報(bào)道。本研究通過(guò)觀察肝癌模型小鼠肝功能胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1及其受體抑制劑鬼臼苦素(PPP)表達(dá)的影響，來(lái)探究miR-125a靶向基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的作用。

1資料與方法

1.1材料

1.1.1試劑1640完全培養(yǎng)基(Gibco公司)、胎牛血清(Gibco公司)、胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲亞砜(DMSO)、羊抗兔、羊抗鼠二抗(SouthernBiotech 公司)、免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.1.2細(xì)胞株和菌株人肝癌細(xì)胞株(HepG2)細(xì)胞由本院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供，人正常肝細(xì)胞株(HL7702)細(xì)胞購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中接種Hep2細(xì)胞,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)表示細(xì)胞生長(zhǎng)良好。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，更換為乙二胺四二酸(EDTA)溶液和胰蛋白酶的消化液消化，消化液與細(xì)胞充分接觸，室溫放置待細(xì)胞皺縮或已離開瓶壁呈游離狀態(tài)，加入完全培養(yǎng)液以終止消化。吹洗細(xì)胞生長(zhǎng)面,使全部細(xì)胞完全脫離瓶壁。反復(fù)吹打使細(xì)胞完全分開。離心，棄上清，并調(diào)整細(xì)胞濃度，吸取一定量細(xì)胞于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),在孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2miR-125a 轉(zhuǎn)染的模型建立將miR-125a基因克隆至載體pGenesil-1質(zhì)粒，構(gòu)建為重組質(zhì)粒pGenesil-miR-125a。經(jīng)限制性內(nèi)切酶來(lái)證實(shí)可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)設(shè)計(jì)質(zhì)粒對(duì)照組，并按照說(shuō)明書用pGenesilmiR-125a及對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞。篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hep2細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。

1.3檢測(cè)指標(biāo)及觀察方法

1.3.1miR-125a對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用的檢測(cè)應(yīng)用MTT法：將細(xì)胞收集到含胎牛血清的培養(yǎng)基中。離心使細(xì)胞沉積，加到培養(yǎng)基中重懸，計(jì)數(shù)細(xì)胞。將細(xì)胞稀釋，注意吹打，種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)，在孔中加入20 μl MTT溫育4 h。加入DMSO，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀記錄OD值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.2IGF-1、PPP水平的檢測(cè)免疫組化法檢測(cè) IGF-1、PPP的水平，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解 30 min；完成后將細(xì)胞置于離心管中離心，用過(guò)氧化物酶阻斷酶的活性，PBS沖洗,用鏈霉菌素-生物素復(fù)合物(sABC)免疫組化試劑盒檢測(cè)IGF-1、PPP表達(dá)水平。Ⅰ抗分別為兔抗鼠IGF-1抗體及PPP5抗體,按試劑盒說(shuō)明書操作。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,脫水,透明,封片。于光鏡下觀察IGF-1、PPP陽(yáng)性率。每張切片選取5個(gè)視野，計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖情況比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,活細(xì)胞數(shù)量明顯降低，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖情況：1、3、5、7 d OD值分別為1.36±0.28,2.58±1.17,3.01±1.34,3.54±1.50；對(duì)照組分別為1.43±0.39,2.26±0.99,3.74±1.15,5.58±1.82(P<0.05)。

2.2IGF-1、PPP水平比較隨著細(xì)胞的增殖，兩組細(xì)胞的IGF-1陽(yáng)性率均降低(干預(yù)前實(shí)驗(yàn)組為26.98±10.27，對(duì)照組為28.37±12.42；干預(yù)組后分別為20.17±12.38,16.18±15.14),與實(shí)驗(yàn)組相比，對(duì)照組下降更為明顯(P<0.05)。對(duì)照組細(xì)胞PPP陽(yáng)性率未發(fā)生明顯變化(干預(yù)前14.16±5.09，干預(yù)后16.37±12.19)(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞PPP陽(yáng)性率明顯升高(干預(yù)前15.17±6.87，干預(yù)后25.17±9.27)(P<0.05)。

圖1　兩組細(xì)胞IGF-1比較

圖2　兩組細(xì)胞PPP陽(yáng)性率比較

3討論

肝癌是世界第五大惡性腫瘤,全球每年新發(fā)病例數(shù)約 65 萬(wàn)，死亡數(shù)約為 60 萬(wàn)〔4〕，在中國(guó)是第二大惡性腫瘤。由于其起病隱匿，惡性程度高，病情發(fā)展迅速，其發(fā)病率幾乎等同于致死率，因此導(dǎo)致患者的生存期短，死亡率高。肝癌的發(fā)病機(jī)制是多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程,其分子生物學(xué)機(jī)制還沒有完全闡明。miRNA 通過(guò)抑制 mRNA 的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后沉默基因，對(duì)生物體的發(fā)育、分化、增殖等生理活動(dòng)過(guò)程中進(jìn)行精確調(diào)節(jié)〔5〕。有學(xué)者通過(guò)對(duì)microRNA 的表達(dá)芯片分析，發(fā)現(xiàn)了miR-125a在肝癌組織中低表達(dá)。因此miR-125a靶向基因?qū)τ诟伟┑陌l(fā)生和發(fā)展具有一定的作用〔6〕。

IGF-1是一種重要生長(zhǎng)刺激因子，由肝細(xì)胞合成和分泌。 IGF-1基因定位在染色體12,全長(zhǎng)100 kb,編碼70氨基酸的單鏈蛋白多肽。IGF-1的表達(dá)主要受生長(zhǎng)激素的調(diào)節(jié)。有研究表明〔7〕，IGF-1通過(guò)類胰島素樣作用，促進(jìn)組織攝取葡萄糖，增加細(xì)胞對(duì)糖原和氨基酸的吸收，刺激糖酵解和糖異生進(jìn)而促進(jìn)脂肪和蛋白質(zhì)的合成，其生物學(xué)活性主要受IGF-1受體及其結(jié)合蛋白(IGFBPs)的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞的增殖、分裂及凋亡過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。目前，IGF-1在肝癌中的作用仍存在一定爭(zhēng)議。有文獻(xiàn)報(bào)道〔8〕，IGF-1在乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌中都出現(xiàn)高表達(dá)，但在肝癌患者血清中的表達(dá)卻下降 。血清IGF-1水平升高在肝癌形成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用〔9〕。PPP是IGF-1受體抑制劑，針對(duì)IGF-1酪氨酸激酶。PPP具有順式內(nèi)酯環(huán),因此其對(duì)微管蛋白無(wú)抑制作用,不影響ATP激酶和胰島素受體的活性,卻能抑制IGF- 1受體活性。與其他的 IGF-1R 抑制劑相比，PPP 具有更強(qiáng)的特異性，并且與胰島素受體有更小的交叉反應(yīng)，有研究表明其對(duì)乳腺癌、肺癌、前列腺癌等有明顯的抑制作用〔10〕。也有研究證實(shí)PPP 對(duì)肝癌的作用，PPP 會(huì)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡〔11〕。會(huì)對(duì)肝癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、破碎，與周圍細(xì)胞脫離等情況，但PPP 對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲機(jī)制尚未完全闡明。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-125a可以升高PPP的水平從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖。因此，總體來(lái)說(shuō)，miR-125a靶向基因能夠降低肝癌細(xì)胞IGF-1水平，升高其受體抑制劑PPP的水平，抑制肝癌細(xì)胞的增殖，對(duì)臨床有指導(dǎo)意義。

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〔2014-11-27修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)