共價(jià)有機(jī)聚合物固相萃取/高效液相色譜法測(cè)定面粉中3種熒光增白劑

丁 惠，紀(jì)文華，賀吉香*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測(cè)試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

熒光增白劑(FWAs)是一種具有復(fù)雜化學(xué)結(jié)構(gòu)的熒光染料，由于其在吸收不可見(jiàn)紫外光(290～400nm)的同時(shí)可以發(fā)射比入射光范圍更廣的可見(jiàn)光(400～480nm)，所以能夠提高基質(zhì)的白度和亮度[1]。當(dāng)前，F(xiàn)WAs被廣泛應(yīng)用于造紙、洗滌劑、塑料、紡織纖維等產(chǎn)品中，以達(dá)到增白增艷的效果[2]。為追求經(jīng)濟(jì)利益，一些不法商家將FWAs添加到食品及其包裝材料中以提高產(chǎn)品的外觀，吸引消費(fèi)者。FWAs在人體內(nèi)會(huì)與人血清蛋白結(jié)合，進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，而FWAs特殊的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其難以通過(guò)新陳代謝正常排出體外，從而在體內(nèi)蓄積危及人類(lèi)健康[3]。此外，F(xiàn)WAs會(huì)阻礙傷口愈合，且一旦在體內(nèi)蓄積過(guò)量，將成為潛在的致癌因素[4]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T27741-2011和GB31604.47-2016中規(guī)定了紙制品和食品接觸材料中相關(guān)FWAs的檢測(cè)方法及檢出限，衛(wèi)生部《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單(第四批)》明確指出面粉中的熒光增白劑為違法添加的非食用物質(zhì)。因此迫切需要建立一種高效便捷的食品中FWAs的檢測(cè)方法。目前，F(xiàn)WAs的檢測(cè)方法主要有熒光分光光度法[5]、紫外分光光度法[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7]以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[8-9]。鑒于樣品基質(zhì)復(fù)雜，成分多樣，且基質(zhì)中FWAs的添加水平較低，因此選擇合適的前處理方法實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的有效富集十分重要。

固相萃取(SPE)作為目前廣泛應(yīng)用的一種樣品前處理方法，在食品檢測(cè)[10]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[11]、生物樣品分析[12]等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。SPE能有效避免大量有機(jī)溶劑的使用，同時(shí)具有基質(zhì)效應(yīng)小、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的快速富集[13-15]。除了傳統(tǒng)的C18、硅膠、氧化鋁和氨基等固相萃取填料外，金屬有機(jī)框架材料、氧化石墨烯、碳納米管等新興材料由于具有良好的吸附性能和較高的穩(wěn)定性而得到廣泛關(guān)注[16-19]。本文選擇三氯化鉍作為催化劑，使2,4,6-三羥基-1,3,5-苯三甲醛和2,6-二氨基吡啶在低溫下聚合成一種具有良好吸附性能的共價(jià)有機(jī)多孔聚合物(COPs)。將COPs成功應(yīng)用于固相萃取填料，基于此建立了熒光增白劑的高效液相色譜檢測(cè)方法，該方法具有較好的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，能夠用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet儀器公司);JW-BK132F型比表面積測(cè)定儀(北京精微高博科學(xué)技術(shù)有限公司);固相萃取裝置(美國(guó)Supelco公司);Waters e2695高效液相色譜儀，配2998二極管陣列檢測(cè)器及Empower3色譜工作站(美國(guó)Waters公司);超純水由Milli-Q系統(tǒng)制得(美國(guó)Millipore公司)。

圖1 3種熒光增白劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of three FWAs

1.2 COPs的制備

在50mL圓底燒瓶中加入0.63g TFP和0.22g2,6-DAP，加入14mL1,3,5-三甲基苯和二氧六環(huán)(6∶1，體積比)的混合溶劑，再加入0.013g BiCl3，超聲10min后密封，置于室溫下聚合反應(yīng)8h。離心除去上清液，所得反應(yīng)產(chǎn)物用濾紙包裹置于索氏提取器中，以甲醇-三氟乙酸(9∶1，體積比)回流24h除去未反應(yīng)的原料，再用甲醇洗至中性，真空干燥24h。研磨后得到褐色產(chǎn)物，避光保存。

1.3 等溫吸附實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取10mg COPs加至10mL螺口玻璃瓶中，然后加入2.5mL系列質(zhì)量濃度的3種FWAs標(biāo)準(zhǔn)溶液(1～60mg·L-1)，室溫振蕩120min后，離心去除聚合物，上清液過(guò)0.45μm濾膜并采用HPLC測(cè)定。聚合物的平衡吸附量(Qe,mg·g-1)由下式計(jì)算得到：Qe=(Ci-Ce)V/m，其中，Ci(g·L-1)和Ce(g·L-1)分別為FWAs的初始質(zhì)量濃度和吸附達(dá)平衡時(shí)的質(zhì)量濃度；V(mL)為標(biāo)準(zhǔn)溶液體積；m(mg)為聚合物的質(zhì)量。

1.4 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

將10mg COPs加至10mL螺口玻璃瓶中，然后加入2.5mL50mg·L-1的FWAs標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫下振蕩3～80min，離心后取上清液，過(guò)0.45μm濾膜并采用HPLC測(cè)定，以考察聚合物對(duì)目標(biāo)分析物的傳質(zhì)速率。

1.5 液相色譜條件

色譜柱：Symmetry?C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：370nm；流速：1.0mL·min-1；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%三氟乙酸水溶液，梯度洗脫程序：0～4min，94% A；4～5min，94%～91% A；5～16min，91%A。

1.6 實(shí)際樣品的制備

實(shí)驗(yàn)用面粉均購(gòu)自濟(jì)南當(dāng)?shù)爻?、市?chǎng)和糧油店。精密稱(chēng)取1.0000g樣品于100mL錐形瓶中，以50mL 氯仿超聲提取30min，離心后，取上清液用氯仿定容至50mL，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 COPs的制備

相較于傳統(tǒng)的高溫聚合方法，本實(shí)驗(yàn)借鑒Matsumoto等[20]的研究，采用低溫聚合的方法使單體快速聚合。考察了原料的不同配比對(duì)聚合物吸附容量(Qe)的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)TFP和2,6-DAP的摩爾比為3∶2時(shí)，Qe達(dá)最大值(0.28mg·g-1)，隨著原料中2,6-DAP的增多，Qe有所下降。同時(shí)評(píng)價(jià)了另外3種催化劑(Sc(OTf)3、InCl3.4H2O、TsOH)所制聚合物的吸附能力，得到其Qe分別為0.11、0.14、0.06mg·g-1，均低于BiCl3催化下形成的COPs對(duì)目標(biāo)分析物的吸附容量(0.28mg·g-1)，因此實(shí)驗(yàn)最終選擇BiCl3作為合成COPs的催化劑。

2.2 COPs的性能表征

2.2.1比表面積根據(jù)BET氮?dú)馕降葴鼐€評(píng)價(jià)COPs的物理特性，測(cè)得COPs的比表面積為271 m2·g-1，相應(yīng)的孔穴體積為0.120 m3·g-1，表明COPs具有多孔性，從而具有較大的吸附容量。根據(jù)IUPAC分類(lèi)，COPs的N2吸附等溫線的形狀可歸屬于Ⅳ型等溫線，推斷聚合物為介孔類(lèi)吸附劑材料。

圖2 COPs的紅外光譜Fig.2 FT-IR spectra of COPs

2.3 等溫吸附實(shí)驗(yàn)

利用等溫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定COPs對(duì)FWA 367、FWA 368和FWA 393的吸附量(圖3A)，結(jié)果顯示，COPs的吸附量隨著FWAs質(zhì)量濃度的增大而增加。當(dāng)FWA 368、FWA 367和FWA 393的初始質(zhì)量濃度分別超過(guò)40、30、30 mg·L-1時(shí)，COPs對(duì)目標(biāo)化合物的平衡吸附量不再變化，此時(shí)達(dá)到飽和吸附容量。

選擇Freundlich和Langmuir吸附模型評(píng)估COPs對(duì)3種FWAs的吸附性能，結(jié)果見(jiàn)表1，KF和KL分別為兩方程的平衡常數(shù)，n為吸附強(qiáng)度，Qm為理論最大吸附量。根據(jù)計(jì)算結(jié)果可知，F(xiàn)reundlich吸附模型與數(shù)據(jù)的擬合關(guān)系更好(r2≥0.921)；n>1，表明COPs對(duì)FWAs的吸附存在多種不同的結(jié)合位點(diǎn)，具有良好的吸附性能。

表1 COPs吸附FWAs的Freundlich和Langmuir吸附模型Table 1 Freundlich adsorption models and Langmuir isotherm models for FWAs onto COPs

*ydenotes lgQe，xdenotes lgCe;**ydenotesCe/Qe,xdenotesQe

2.4 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

計(jì)算不同時(shí)間內(nèi)聚合物對(duì)50 mg·L-1FWA 367、FWA 368和FWA 393的吸附容量，可得到COPs對(duì)FWAs的動(dòng)態(tài)吸附曲線(圖3B)，COPs對(duì)3種FWAs具有較高的傳質(zhì)速率，F(xiàn)WA 367、FWA 368和FWA 393分別在30、40、35 min達(dá)到最大吸附量。

吸附動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分別用Lagergren準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合分析(表2)，其中k1和k2分別為兩方程的吸附速率常數(shù)，Qe分別由實(shí)驗(yàn)和擬合方程得出。由表2可知，準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的擬合相關(guān)系數(shù)(r2≥0.868)相對(duì)較高，且由準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型得到的平衡吸附量與實(shí)驗(yàn)值更為接近，故準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型更適用于本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析。

表2 COPs吸附FWAs的準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型Table 2 Pseudo-first order kinetic model and pseudo-second order kinetic model for FWAs onto COPs

2.5 固相萃取(SPE)條件的優(yōu)化

通過(guò)3種熒光增白劑在氯仿、乙酸乙酯、丙酮、四氫呋喃、甲醇、乙腈等不同有機(jī)溶劑中的溶解性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氯仿可以較好地溶解FWA 367、FWA 368和FWA 393，因此選用氯仿作為樣品萃取溶劑及SPE上樣溶劑。

2.5.1吸附劑的用量將40～150 mg聚合物分別裝填到1 mL的固相萃取小柱中，考察不同吸附劑用量對(duì)3種熒光增白劑的吸附效果。結(jié)果顯示，當(dāng)吸附劑用量為100 mg時(shí)，F(xiàn)WA 367、FWA 368和FWA 393的回收率分別為97.2%、98.4%和94.1%。當(dāng)吸附劑用量小于100 mg時(shí)，回收率降至90%以下；而當(dāng)吸附劑用量高于100 mg時(shí)，上樣流速降低，分析時(shí)間延長(zhǎng)。因此實(shí)驗(yàn)確定吸附劑的最佳用量為100 mg。

2.5.2流速的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)上樣流速為1～5 mL·min-1時(shí)，3種熒光增白劑的回收率均大于90%；當(dāng)流速增至6 mL·min-1時(shí)，F(xiàn)WA 367、FWA 368和FWA 393的回收率分別降至72.3%、81.5%和76.7%。綜合考慮分析時(shí)間和回收率，最終確定流速為5 mL·min-1。

2.5.3洗脫劑的優(yōu)化分別選用甲醇-三氟乙酸(9∶1)、氯仿-甲醇-三氟乙酸(6∶3∶1)和氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)作為洗脫劑，考察了不同體積比的洗脫劑對(duì)FWAs的洗脫能力，同時(shí)考察了不同體積(1～9 mL)的洗脫劑對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響。結(jié)果表明，以5 mL的氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)為洗脫劑時(shí)，F(xiàn)WA 367、FWA 368和FWA 393的回收率分別為98.2%、101%和98.7%，因此實(shí)驗(yàn)選用5 mL的氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)作為洗脫劑。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

將3種FWAs標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋?zhuān)玫劫|(zhì)量濃度分別為1、10、20、30、40、60、70、80、90、100 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最優(yōu)固相萃取條件下，洗脫液經(jīng)HPLC依次測(cè)定，3種FWAs在1～100 μg·L-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r2≥0.996 2)。以3倍信噪比(S/N=3)時(shí)的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限(LOD)，S/N=10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量下限(LOQ)，得到3種FWAs的LOD為0.15～0.27 μg·kg-1，LOQ為0.50～0.89 μg·kg-1(見(jiàn)表3)，表明該方法具有較高的檢測(cè)靈敏度。

表3 3種FWAs的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Linear relationships,detection limits,quantitation limits，recoveries and RSDs of three FWAs

對(duì)陰性面粉基質(zhì)進(jìn)行3種不同水平(10、30、60 μg·kg-1)FWAs標(biāo)準(zhǔn)溶液的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=6)，由表3可知，樣品經(jīng)SPE富集后，3種FWAs的回收率為81.2%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)為4.3%～12.7%。

相比于其他文獻(xiàn)方法(表4)，本方法具有較低的檢出限和定量下限，同時(shí)樣品前處理方法簡(jiǎn)單，有機(jī)溶劑用量少，具有相對(duì)較高的回收率，結(jié)果準(zhǔn)確，能夠?qū)崿F(xiàn)面粉中熒光增白劑的定性定量檢測(cè)。

表4 樣品中熒光增白劑的檢測(cè)方法比較Table 4 Comparison of the proposed method with other methods for the determination of FWAs in samples

2.7 與商用SPE填料的比較

對(duì)比了C18、硅膠(Silica)、硅酸鎂(Florisil)和中性氧化鋁(Alumina N)為吸附填料的商用SPE柱和COPs固相萃取對(duì)3種FWAs的吸附能力。圖4A為上述5種SPE填料在首次使用時(shí)對(duì)3種FWAs的回收率，其中COPs對(duì)FWAs的回收率高達(dá)98.8%，明顯優(yōu)于其他吸附材料。同時(shí)，以3種FWAs的平均回收率為響應(yīng)值，對(duì)比了上述SPE柱經(jīng)吸附-解吸附循環(huán)使用后的吸附能力(圖4B)。結(jié)果顯示，以COPs為填料的SPE柱經(jīng)12次循環(huán)使用后，回收率仍高達(dá)87.8%，而其他幾種填料的回收率已降至60%以下，無(wú)法滿(mǎn)足分析檢測(cè)的要求。

2.8 實(shí)際樣品的應(yīng)用

將COPs作為吸附劑，以?xún)?yōu)化后的SPE條件對(duì)面粉中的FWAs進(jìn)行富集，取100 mg的COPs裝填到SPE小柱中，經(jīng)3 mL甲醇和2 mL氯仿活化后，將樣品溶液以5 mL·min-1通過(guò)SPE小柱，然后用5 mL氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)洗脫，洗脫速度為1 mL·min-1，洗脫液用氯仿定容至5 mL后按本方法進(jìn)行檢測(cè)。從超市、市場(chǎng)和糧油店隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)10批面粉，經(jīng)上述最優(yōu)條件處理后進(jìn)行檢測(cè)，在2份面粉樣品中檢出FWA 393，含量分別為14.2、11.3 μg·kg-1，表明樣品包裝材料中的熒光增白劑發(fā)生遷移或不法商家違法添加了熒光增白劑。

3 結(jié) 論

本文以TFP和2,6-DAP為單體，BiCl3為催化劑，采用低溫聚合法成功制得具有良好吸附性能的共價(jià)有機(jī)多孔聚合物。通過(guò)BET等溫吸附實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該聚合物具有較大的比表面積和孔穴體積，能夠用于SPE填料。以COPs吸附劑為填料，建立了熒光增白劑的SPE/HPLC分析技術(shù)，方法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，可實(shí)現(xiàn)熒光增白劑的快速富集，并成功應(yīng)用于面粉中3種熒光增白劑的高靈敏檢測(cè)。