SHOX2基因甲基化水平對(duì)肺癌和良性肺部疾病的鑒別診斷研究

夏冬平，史小武，周 穎，朱 珊

本文意義：目前，低劑量CT代替?zhèn)鹘y(tǒng)的胸部X線片作為肺癌高危人群的早期篩查，可以明顯降低周圍型肺癌的病死率。但其對(duì)早期中央型肺癌和癌前病變，尤其是小細(xì)胞肺癌和早期鱗狀細(xì)胞肺癌的檢出率并不理想。本研究分析了肺癌及良性肺部疾病患者中SHOX2基因甲基化水平的差異，進(jìn)一步探索了SHOX2基因甲基化水平對(duì)早期肺癌患者的診斷效能，發(fā)現(xiàn)其診斷早期小細(xì)胞肺癌和鱗狀細(xì)胞癌的能力較高，聯(lián)合血清胃泌素釋放肽前體的診斷效能更勝一籌，有望成為肺癌早期非侵入性檢查的方案之一，進(jìn)一步提高肺癌的檢出率，并降低病死率。

目前診斷肺癌最常用的支氣管鏡、經(jīng)支氣管鏡肺活檢等內(nèi)鏡檢查技術(shù)雖特異度及靈敏度較高，但均為有創(chuàng)操作，給患者帶來額外痛苦［1］。2015年原發(fā)性肺癌診療規(guī)范推薦，常用的血清胃泌素釋放肽前體（ProGRP）、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（SCC-Ag）、細(xì)胞角蛋白21片段抗原（Cyfra21-1）及癌胚抗原（CEA）等腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)對(duì)肺癌診斷具有一定的臨床價(jià)值［2］。但倪軍等［3］研究表明腫瘤標(biāo)志物單獨(dú)使用的靈敏度均低于60%，而聯(lián)合使用則降低其特異度。KNEIP等［4］研究表明，通過檢測(cè)血漿SHOX2基因甲基化診斷肺癌的靈敏度為60%，特異度為90%，但并未對(duì)良性肺部疾病患者和健康人群SHOX2基因甲基化水平進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)。此外，目前關(guān)于血漿SHOX2基因甲基化診斷肺癌的相關(guān)臨床研究仍較少。因此，本研究通過比較肺癌患者和良性肺部疾病患者的血漿SHOX2基因甲基化水平以及進(jìn)一步探索SHOX2基因甲基化水平與肺癌類型、TNM分期的關(guān)系，旨在為臨床肺癌的診治提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《2007中國(guó)肺癌臨床指南》［5］診斷為肺癌的患者，根據(jù)《中國(guó)肺部結(jié)節(jié)分類、診斷與治療指南（2016年版）》［6］確診為結(jié)節(jié)、結(jié)核、炎癥等與早期肺癌臨床癥狀相似的良性肺部疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往行肺部手術(shù)治療或行肺癌相關(guān)化療、免疫治療、靶向治療的肺癌患者；（2）其他部位原發(fā)性腫瘤的肺癌患者；（3）肺部結(jié)節(jié)未行病理檢查排除肺癌的良性肺部疾病患者；（4）合并有其他惡性腫瘤的良性肺部疾病患者。選取2014年3月—2016年6月武漢市中心醫(yī)院胸外科、呼吸科住院的肺癌患者和良性肺部疾病患者為研究對(duì)象。肺癌患者173例作為肺癌組，其中腺癌72例，鱗狀細(xì)胞癌68例，小細(xì)胞癌15例，大細(xì)胞癌8例，其他未知病理類型10例；TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期28例，Ⅲ期76例，Ⅳ期47例。良性肺部疾病患者194例作為良性肺病組，其中肺部感染73例，慢性阻塞性肺疾?。–OPD）32例，哮喘24例，支氣管擴(kuò)張23例，肺栓塞15例，纖維組織增生性小結(jié)節(jié)、錯(cuò)構(gòu)瘤等其他肺部疾病27例。患者及家屬均簽署知情同意書，本研究獲武漢市中心醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 常規(guī)血清學(xué)檢查 入院第2天抽取晨起空腹靜脈血5 ml，其中2 ml置入乙二胺四乙酸二鉀抗凝的真空采血管，檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板計(jì)數(shù)。取3 ml置入無抗凝劑的真空采血管，離心半徑為13.5 cm，以3 000 r/min離心10 min后，分離血清，-70 ℃保存，24 h內(nèi)采用BS-220全自動(dòng)生化分析儀（邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、清蛋白（ALB）、總膽紅素（TBiL）、直接膽紅素（DBiL）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）。

1.2.2 腫瘤標(biāo)志物檢測(cè) 入院第2天抽取晨起空腹靜脈血5 ml，置入無抗凝劑的真空采血管中，靜置30 min后，離心半徑為8 cm，以2 500 r/min離心20 min后留取上清液，置于4 ℃條件下保存待檢，采用羅氏Elecsys 2010電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀及配套試劑檢測(cè)血清ProGRP、SCC-Ag、Cyfra21-1及CEA。所有過程由經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師按照說明書操作完成。

1.2.3 血漿SHOX2基因甲基化檢測(cè) 抽取患者空腹靜脈血5 ml，置入枸櫞酸鈉抗凝管中，離心半徑為10 cm，以2 000 r/min離心20 min后分離血漿，并在4 ℃條件下保存待檢。主要試劑：DNA提純?cè)噭┖校ㄉ虾W孚生物醫(yī)藥科技有限公司，型號(hào)：DM6150P）；DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒（艾美捷科技有限公司，型號(hào)：ENZ-45001-0050）；甲基化陽(yáng)性對(duì)照試劑盒（QIAGEN公司，型號(hào)：59655）；引物及探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；2×TAG PCR MIX（北京歐比特科技有限公司產(chǎn)品）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀器（美國(guó)RioRad公司）。方法：（1）采用DNA提取試劑盒提取血漿DNA，并采用v-1200分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及純度；（2）將提純的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽化；（3）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為90 ℃預(yù)變性20 min，55個(gè)循環(huán)；95 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s；每個(gè)樣本重復(fù)2次（引物及探針序列見表1）；（4）采用Sanger測(cè)序法檢測(cè)SHOX2基因甲基化，PCR產(chǎn)物由威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司測(cè)序；（5）采用ΔΔCT法計(jì)算SHOX2基因甲基化水平，ΔΔCT值越低，表示SHOX2基因甲基化水平越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料的分析采用χ2檢驗(yàn)；采用多因素Logistic回歸分析肺癌的影響因素；采用受試者工作特征（ROC）曲線分析各指標(biāo)鑒別肺癌的價(jià)值；ROC曲線下面積（AUC）比較采用Z檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列Table1 Prime sequence of real time fluorescent quantitative PCR

表2 兩組患者基線資料比較Table2 Comparison of baseline data between the two groups

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料比較 兩組患者性別、年齡、Hb、血小板計(jì)數(shù)、ALT、AST、ALB、TBiL、DBiL、BUN、Cr比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；肺癌組患者WBC、ΔΔCT值均低于良性肺病組，ProGRP、SCC-Ag、Cyfra21-1、CEA均高于良性肺病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.2 良性肺病組不同疾病患者ΔΔCT值比較 良性肺病組不同疾病患者ΔΔCT值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表3）。

2.3 肺癌影響因素的多因素Logistic回歸分析 以是否患有肺癌（賦值：否=0，是=1）為因變量，以WBC、ProGRP、SCC-Ag、Cyfra21-1、CEA、ΔΔCT值為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，ProGRP、Cyfra21-1、ΔΔCT值是肺癌的影響因素（P＜0.05，見表4）。

2.4 不同指標(biāo)診斷肺癌的ROC曲線及指標(biāo) 以ΔΔCT值、血清ProGRP、血清Cyfra21-1為檢驗(yàn)變量，以肺癌發(fā)生情況為分類變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示ΔΔCT值診斷肺癌的AUC為0.843，最佳臨界值為2.69時(shí)，靈敏度為58.2%，特異度為93.1%；血清ProGRP診斷肺癌的AUC為0.711，最佳臨界值為32 ng/L時(shí)，靈敏度為63.5%，特異度為77.4%；血清Cyfra21-1診斷肺癌的AUC為0.677，最佳臨界值為2.92 μg/L時(shí)，靈敏度為56.1%，特異度為72.3%。血清ProGRP診斷肺癌的AUC大于血清Cyfra21-1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=3.569，P=0.038）。以ΔΔCT值聯(lián)合血清ProGRP為檢驗(yàn)變量，以肺癌發(fā)生情況為分類變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示AUC為0.860。ΔΔCT值聯(lián)合血清ProGRP診斷肺癌的AUC均大于ΔΔCT值、血清ProGRP、血清Cyfra21-1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=4.046、5.607、8.215，P＜0.05，見圖1）。

2.5 肺癌組不同病理類型患者ΔΔCT值比較 肺癌組不同病理類型患者ΔΔCT值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌患者ΔΔCT值均低于腺癌、大細(xì)胞癌、其他未知病理類型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表5）。

2.6 肺癌組不同TNM分期患者ΔΔCT值比較 肺癌組不同TNM分期患者ΔΔCT值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，Ⅲ期患者ΔΔCT值低于Ⅰ期、Ⅱ期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅳ期患者ΔΔCT值低于Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表6）。

表3 良性肺病組不同疾病患者ΔΔCT值比較（s）Table3 Comparison of ΔΔCT value level in patients with different diseases in the benign lung disease group

表3 良性肺病組不同疾病患者ΔΔCT值比較（s）Table3 Comparison of ΔΔCT value level in patients with different diseases in the benign lung disease group

注：COPD=慢性阻塞性肺疾病

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表4 肺癌的影響因素的多因素Logistic回歸分析Table4 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors for lung cancer

圖1 不同指標(biāo)診斷肺癌的ROC曲線Figure1 Diagnosis of ROC curve of lung cancer by different indexes

表5 肺癌組不同病理類型患者ΔΔCT值比較（s）Table5 Comparison of ΔΔCT value in patients with different pathological types in lung cancer group

表5 肺癌組不同病理類型患者ΔΔCT值比較（s）Table5 Comparison of ΔΔCT value in patients with different pathological types in lung cancer group

注：與腺癌比較，aP＜0.05；與鱗狀細(xì)胞癌比較，bP＜0.05；與小細(xì)胞癌比較，cP＜0.05

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表6 肺癌組不同TNM分期患者ΔΔCT值比較（s）Table6 Comparison of ΔΔCT value in patients with different TNM stages in lung cancer group

表6 肺癌組不同TNM分期患者ΔΔCT值比較（s）Table6 Comparison of ΔΔCT value in patients with different TNM stages in lung cancer group

注：與Ⅰ期比較，aP＜0.05；與Ⅱ期比較，bP＜0.05；與Ⅲ期比較，cP＜0.05

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3 討論

DNA甲基化在肺癌發(fā)生的早期發(fā)揮著重要作用，且伴隨腫瘤發(fā)展的整個(gè)過程，故其有望成為肺癌診斷的分子標(biāo)志物［7］。近年研究發(fā)現(xiàn)，SHOX2基因甲基化在肺癌患者的5種標(biāo)本（淋巴結(jié)、胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液、腫瘤組織、外周血）中均可檢測(cè)到，但各樣本檢測(cè)的靈敏度差異較大，以腫瘤組織和淋巴結(jié)樣品檢測(cè)靈敏度最高，為94%以上［8］，而胸腔積液樣品則不足40%［9］。值得一提的是，血漿樣品檢測(cè)的靈敏度也可達(dá)60%左右［10］，與有創(chuàng)操作相比，具有較好的操作性和可重復(fù)性，有望成為肺癌早期篩查的工具。

國(guó)內(nèi)大多數(shù)肺癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已至晚期，容易發(fā)生其他臟器的轉(zhuǎn)移和損害，因而會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)多項(xiàng)指標(biāo)的變化［11］。本研究對(duì)入院常規(guī)檢驗(yàn)指標(biāo)如TCL、Hb、血小板計(jì)數(shù)、ALT、AST、BUN、Cr等，常用的血清腫瘤標(biāo)志物如ProGRP、SCC-Ag、Cyfra21-1、CEA，以及血漿SHOX2基因甲基化進(jìn)行分析，單因素分析結(jié)果顯示良性肺病組患者WBC高于肺癌組，多與肺部感染人數(shù)較多、白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增高有關(guān)。肺癌組患者的血清ProGRP、SCC-Ag、Cyfra21-1、CEA及血漿SHOX2基因甲基化水平高于良性肺病組，提示上述指標(biāo)與肺癌的發(fā)生有密切聯(lián)系，需要進(jìn)一步分析。以往多篇研究提示，SHOX2基因甲基化診斷疾病的特異度較高，肺癌陰性患者的陽(yáng)性檢出率較低，誤診率亦不高［12-13］，但本研究結(jié)果顯示，良性肺病組不同疾病患者SHOX2基因甲基化水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與已有研究［12-13］結(jié)果相同。本研究多因素Logistic回歸分析顯示，血清ProGRP、Cyfra21-1及血漿SHOX2基因甲基化水平均為肺癌的獨(dú)立影響因素，提示上述指標(biāo)可在一定程度上獨(dú)立反映肺癌的情況，與OKAMURA等［14］及KORSE等［15］關(guān)于肺癌血清腫瘤標(biāo)志物的研究以及SCHNEIDER等［16］關(guān)于SHOX2基因甲基化診斷肺癌的研究結(jié)果具有較好的一致性。

以往研究大多分別對(duì)血清腫瘤標(biāo)志物和SHOX2基因甲基化水平診斷肺癌進(jìn)行研究，其中單獨(dú)檢測(cè)血清ProGRP的特異度最高，在90%以上，而靈敏度不足20%；而血清Cyfra21-1的靈敏度可達(dá)70%，特異度卻不足50%［17］。血漿SHOX2基因甲基化水平診斷肺癌的靈敏度為60%，特異度為90%［18］。本研究的ROC曲線結(jié)果顯示，血漿SHOX2基因甲基化水平（ΔΔCT值）與血清ProGRP聯(lián)合診斷肺癌的AUC均大于ΔΔCT值、血清ProGRP、血清Cyfra21-1，血清ProGRP診斷肺癌的AUC大于血清Cyfra21-1，提示三者對(duì)肺癌和良性肺部疾病的鑒別診斷具有一定價(jià)值，且血漿SHOX2基因甲基化水平與血清ProGRP聯(lián)合診斷，提高靈敏度，可作為肺癌早期篩查的指標(biāo)。

本研究進(jìn)一步分析血漿SHOX2基因甲基化水平與肺癌患者病理類型及TNM分期的關(guān)系，結(jié)果顯示病理類型中，小細(xì)胞癌的血漿SHOX2基因甲基化程度最高，其次為鱗狀細(xì)胞癌，提示不同病理類型的肺癌SHOX2基因甲基化存在一定的組織特異性，對(duì)小細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌的靈敏度較高，與宋樂樂等［19］的研究結(jié)果一致。Ⅲ期患者的ΔΔCT值低于Ⅰ期、Ⅱ期，Ⅳ期患者的ΔΔCT值低于Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期，表示SHOX2基因甲基化水平可反映病情進(jìn)展，隨著肺癌惡性程度的增高，SHOX2基因甲基化水平增高，更易檢測(cè)；其次，惡性程度高的細(xì)胞壞死及增生活躍導(dǎo)致該樣本DNA含量較高，因而甲基化基因拷貝數(shù)增加［20］。

本研究不足之處為，亞硫酸氫鈉處理后，目標(biāo)DNA鏈不再互補(bǔ)，相當(dāng)于以單鏈為模板進(jìn)行擴(kuò)增，不穩(wěn)定性增加，此時(shí)引物與模板發(fā)生錯(cuò)配的概率增高，可能造成非特異性擴(kuò)增。同時(shí)，由于PCR的最佳擴(kuò)增條件難以摸索，以至擴(kuò)增產(chǎn)物不純或失敗。肺癌患者早期檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)水平較患者本身低，從而導(dǎo)致漏診率提高。另外，考慮儀器、設(shè)備及檢測(cè)技術(shù)等多種原因，本研究SHOX2基因甲基化診斷效能較KNEIP等［4］研究低。因條件有限，未能較好地控制選擇偏倚，SHOX2基因甲基化與肺癌患者的關(guān)系仍需更深入的研究。因此，筆者將在日后應(yīng)用更先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，提高SHOX2基因甲基化的檢出率，同時(shí)，擴(kuò)大樣本量，納入社區(qū)人群，以驗(yàn)證本研究的結(jié)論。

綜上所述，SHOX2基因甲基化鑒別肺癌和良性肺部疾病患者具有一定價(jià)值，可作為診斷肺癌的較好的輔助指標(biāo)之一。

作者貢獻(xiàn)：夏冬平、史小武、周穎、朱珊進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；史小武進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；夏冬平進(jìn)行數(shù)據(jù)收集與整理，撰寫論文；周穎、朱珊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，論文的修訂，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；夏冬平、史小武進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋。

本文無利益沖突。