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    通過(guò)去除花絲確定玉米花粉管通道形成時(shí)間

    2018-12-19 08:51:06李向龍張中保吳忠義
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年22期
    關(guān)鍵詞:花粉管花絲結(jié)實(shí)

    李向龍, 張中保, 張 春, 吳忠義

    (北京市農(nóng)林科學(xué)院生物中心/北京市農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100097)

    花粉管通道法于1983年由周光宇創(chuàng)立,因其無(wú)須組培和植株再生,且技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求低,在玉米轉(zhuǎn)基因育種中得到了廣泛應(yīng)用[1-4]。該方法利用花絲授粉萌發(fā)形成的花粉管通道將生殖細(xì)胞的DNA輸入卵細(xì)胞并最終轉(zhuǎn)化成合子或早期胚胎細(xì)胞[5]。前人利用花粉管通道法進(jìn)行玉米轉(zhuǎn)化并獲得了陽(yáng)性植株[6-7],轉(zhuǎn)化時(shí)間差異較大,從授粉后6~36 h開(kāi)始轉(zhuǎn)化均有報(bào)道,可能是因?yàn)樵趯?shí)際操作過(guò)程中轉(zhuǎn)化材料和外界環(huán)境不同造成的。

    玉米花粉管通道法通道打通時(shí)間段如何確定,是該方法獲得較高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵。張雅君等通過(guò)苯胺藍(lán)染色法和GeneFinderTM核酸染料對(duì)玉米花粉管伸長(zhǎng)進(jìn)程和導(dǎo)入路徑進(jìn)行了研究[8-9],但由于花粉管通道形成受很多自然因素影響,造成了通道形成時(shí)間在材料間有差異。由于花粉管通道只有完全打通,玉米才能正常結(jié)實(shí),因此通過(guò)結(jié)實(shí)始末時(shí)間可以斷定通道打通至關(guān)閉的時(shí)間段,在該時(shí)間段進(jìn)行外源DNA導(dǎo)入,轉(zhuǎn)化效率最高。本研究借助該思路對(duì)2個(gè)玉米試驗(yàn)材料在不同月份、不同溫度下去除花絲,考察其結(jié)實(shí)粒數(shù),初步確定其通道打開(kāi)時(shí)間段、受溫度影響規(guī)律及最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間,以期為花粉管通道法應(yīng)用于玉米轉(zhuǎn)基因育種提供有效方法和指導(dǎo)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在海南省三亞市崖州區(qū)。本研究供試玉米材料為S173、S192,均由北京市農(nóng)林科學(xué)院生物中心選育,為近幾年花粉管通道法轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的骨干材料。

    1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    為觀察2個(gè)試驗(yàn)材料間花粉管通道形成時(shí)間段及受溫度影響的規(guī)律,分別于2015年1月16—20日、3月1—5日、12月26—30日在2個(gè)玉米自交系開(kāi)花前嚴(yán)格套袋,避免花粉提前落到花絲上;在花絲長(zhǎng)至一定程度進(jìn)行授粉,授粉后從3 h開(kāi)始每隔2 h去除1次花絲,直至授粉后31 h結(jié)束,重復(fù)3次,每個(gè)重復(fù)6穗,以同時(shí)段授粉但不去除花絲的雌穗作為對(duì)照;記錄從授粉開(kāi)始至去除花絲期間5 d的溫度。

    在2015年12月、2016年1月對(duì)2個(gè)試驗(yàn)材料通道形成時(shí)間規(guī)律進(jìn)行初步驗(yàn)證,設(shè)2個(gè)處理,處理1依據(jù)之前的經(jīng)驗(yàn)在授粉后18 h進(jìn)行轉(zhuǎn)化,處理2是根據(jù)分析結(jié)果依溫度變幅進(jìn)行調(diào)整。2016年3月對(duì)收獲種子進(jìn)行除草劑篩選,同時(shí)比較2個(gè)處理所得陽(yáng)性株數(shù)。

    1.3 試驗(yàn)方法

    不同處理去除花絲步驟為花絲未伸出苞葉前雌穗提前套袋;花絲露出苞葉達(dá)6~7 cm時(shí)開(kāi)始授粉并再次套袋,標(biāo)注授粉時(shí)間;用小刀將雌穗苞葉從頂部至底部切開(kāi)(圖1-A);注意不要傷及穗軸、弄斷苞葉底部與穗柄連接處,將花絲去除干凈(圖1-B);將苞葉恢復(fù)原狀,頂部用皮筋扎好(圖1-C),標(biāo)注去除花絲時(shí)間;待授粉后20 d取回雌穗,進(jìn)行結(jié)實(shí)粒數(shù)統(tǒng)計(jì)(圖1-D),記錄從授粉開(kāi)始至去除花絲期間的溫度。

    使用Elitech RC-4HA溫度記錄儀記錄授粉至轉(zhuǎn)化期間的溫度,設(shè)定每隔15 min記錄1次;授粉后15 d統(tǒng)計(jì)去除花絲雌穗的結(jié)實(shí)粒數(shù)。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2010進(jìn)行整理和分析,并作圖表。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同去除花絲時(shí)間對(duì)雌穗結(jié)實(shí)部位的影響

    從表1中可以看出,2個(gè)材料從授粉至13 h均未結(jié)實(shí),與對(duì)照表現(xiàn)相同,表明在該時(shí)間段內(nèi)其花粉管通道均未形成;2個(gè)材料雌穗結(jié)實(shí)部位與對(duì)照相似,均是從中部開(kāi)始結(jié)實(shí),再至中下部,最后整穗結(jié)實(shí),該結(jié)果與前人就玉米雌穗結(jié)實(shí)順序研究結(jié)果[10]一致。2個(gè)材料及對(duì)照在3個(gè)月份中開(kāi)始結(jié)實(shí)的順序依次是3、12、1月, 可能與這3個(gè)月中溫度逐漸降低有關(guān);

    表1 不同去除花絲時(shí)間對(duì)雌穗結(jié)實(shí)部位的影響

    注:“—”表示未結(jié)實(shí)。

    在相同月份內(nèi),S192開(kāi)始結(jié)實(shí)的時(shí)間段要早于S173,表明其花粉管通道形成的時(shí)間要早于S173,因此在利用花粉管通道法轉(zhuǎn)化該材料時(shí),轉(zhuǎn)化時(shí)間要適當(dāng)提前。

    2.2 不同月份去除花絲時(shí)段的溫度變化

    從圖2可以看出,相同月份去除花絲的5 d內(nèi)溫度變化不大,較為穩(wěn)定;不同月份去除花絲間日均溫度差異較大,3月最高,溫度在26.5~27.0 ℃之間,12月次之,溫度在 24.0~25.5 ℃ 之間,1月溫度最低,溫度在20.0~21.5 ℃之間,表明2個(gè)材料在3、12、1月間開(kāi)始結(jié)實(shí)時(shí)間延遲與溫度變化有很大的關(guān)系。

    2.3 去除花絲時(shí)間對(duì)雌穗結(jié)實(shí)粒數(shù)的影響

    2.3.1 不同月份去除花絲時(shí)間對(duì)S173結(jié)實(shí)率的影響 由圖3可見(jiàn),S173平均結(jié)實(shí)粒數(shù)在不同月份間都是隨著去除花絲時(shí)間的推移逐漸升高,1月是從21 h開(kāi)始結(jié)實(shí)至27 h處于上升過(guò)程,29 h后變得平緩,說(shuō)明花粉管通道是從21 h開(kāi)始形成且通道數(shù)量逐漸增多;3月試驗(yàn)時(shí)是從17 h開(kāi)始結(jié)實(shí),再往后結(jié)實(shí)粒數(shù)上升明顯,至21 h上升平緩,說(shuō)明花粉管通道是從17 h開(kāi)始形成然后通道數(shù)量逐漸增多;12月是從19 h開(kāi)始結(jié)實(shí),然后結(jié)實(shí)粒數(shù)逐漸升高,23 h后上升緩慢,表明花粉管通道是在該時(shí)間段內(nèi)數(shù)量較多。去除花絲試驗(yàn)期間溫度由高到底的順序依次為3、12、1月,可見(jiàn)花粉管通道形成與溫度密切相關(guān),溫度越高,花粉管通道形成越早,反之則形成延遲。

    2.3.2 不同月份去除花絲時(shí)間對(duì)S192結(jié)實(shí)率的影響 由圖4可見(jiàn),S192平均結(jié)實(shí)粒數(shù)在3次去除花絲中隨時(shí)間變化的趨勢(shì)與S173相似。1月結(jié)實(shí)粒數(shù)從19 h開(kāi)始升高至25 h變得平緩,說(shuō)明花粉管通道在此時(shí)段內(nèi)打通數(shù)量較多;12月結(jié)實(shí)粒數(shù)從17 h后開(kāi)始逐漸升高,至23 h后變得平緩,表明通道數(shù)量在此時(shí)間段較多;3月其開(kāi)始結(jié)實(shí)較前2個(gè)月早,從 15 h 開(kāi)始結(jié)實(shí),逐漸升高后至21 h開(kāi)始變得平緩,說(shuō)明此時(shí)段通道打通數(shù)量較多。結(jié)果表明,S192花粉管通道打通易受溫度影響,溫度升高花粉管通道打開(kāi)時(shí)間提前,反之則延遲。

    2.4 2個(gè)玉米材料最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間確定

    由表2可見(jiàn),隨著溫度在1、12、3月3個(gè)月間不斷升高,2個(gè)玉米材料在授粉后的結(jié)實(shí)時(shí)間段均有提前的趨勢(shì),說(shuō)明溫度對(duì)2個(gè)玉米材料結(jié)實(shí)性有較大的影響,在溫度相近時(shí),S192的結(jié)實(shí)時(shí)間段要早于S173。當(dāng)日均溫度為20.0~21.5 ℃時(shí),S173結(jié)實(shí)時(shí)間段為授粉后21~27 h,表明其花粉管通道形成在該時(shí)段內(nèi)處于高峰期,S192稍早,其花粉管通道形成是在授粉后19~25 h;當(dāng)日均溫度為24.0~25.5 ℃時(shí),S173花粉管通道形成在授粉后19~23 h,S192在授粉后 17~21 h間處于通道形成高峰期;當(dāng)日均溫度為26.5~27.0 ℃ 時(shí),S173花粉管通道授粉后17~21 h形成,S192花粉管通道在15~19 h間形成。表明花粉管通道形成時(shí)間受日均溫度影響較大,只有在上述溫度對(duì)應(yīng)上述時(shí)間段時(shí)對(duì)2個(gè)玉米材料進(jìn)行花粉管通道法轉(zhuǎn)化才能達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化效果。

    表2 不同溫度條件下2個(gè)玉米材料確定結(jié)實(shí)時(shí)間段

    2.5 通道形成時(shí)間驗(yàn)證

    從表3中可以看出,S192在2015年12月處理1、處理2所得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率相近,由于其轉(zhuǎn)化時(shí)間正好處于最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間段內(nèi)。除此之外,其他處理在同期授粉和相同溫度下,處理2得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率均明顯高于處理1,表明通過(guò)去除花絲法確定花粉管通道形成時(shí)間是可行的。而在授粉時(shí)間和溫度均相同時(shí),S173得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率略高于S192,說(shuō)明花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率與受體材料有一定的關(guān)系。

    3 結(jié)論與討論

    玉米正常結(jié)實(shí)的前提是花粉管通道完全打通,而通道形成也須要一個(gè)過(guò)程,雖然在此過(guò)程中先形成的通道有關(guān)閉的,但還有不斷打通的,花粉管通道法須要在花粉管通道打通的高峰時(shí)間段進(jìn)行轉(zhuǎn)化才能獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。本試驗(yàn)中2個(gè)材料在雌穗結(jié)實(shí)部位的順序依次為中部、中下部、頂部,在中下部結(jié)實(shí)時(shí)結(jié)實(shí)數(shù)較多,說(shuō)明花粉管通道形成較多。

    表3 2個(gè)材料在不同溫度和不同轉(zhuǎn)化時(shí)間條件下得到陽(yáng)性株數(shù)

    花粉管通道法在實(shí)際操作過(guò)程中受外界環(huán)境影響較大,如溫度、濕度、光照等,且月份間、年度間上述因素都會(huì)有差異。本試驗(yàn)考察了溫度因素對(duì)結(jié)實(shí)的影響,當(dāng)溫度較高時(shí),2個(gè)材料結(jié)實(shí)起始時(shí)間較早,說(shuō)明通道形成早,在實(shí)際轉(zhuǎn)化時(shí)要適當(dāng)提前;反之,通道形成要慢些,轉(zhuǎn)化要相應(yīng)推遲。

    在對(duì)花粉管通道形成時(shí)間段進(jìn)行驗(yàn)證時(shí),本試驗(yàn)在確定的最佳時(shí)間內(nèi)(處理2)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,其陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率要高于處理1,說(shuō)明利用去除花絲法確定花粉管通道形成時(shí)間是可行的;本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)S192在3個(gè)月份間結(jié)實(shí)時(shí)間早于S173,說(shuō)明其花粉管通道形成要早于S173,表明試驗(yàn)材料不同,通道形成時(shí)間會(huì)有差異,本試驗(yàn)提供的是一種確定花粉管通道打通時(shí)間的方法,最終進(jìn)行花粉管通道法轉(zhuǎn)化時(shí)還須因時(shí)、因地、因品種而進(jìn)行適當(dāng)?shù)男拚?/p>

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