TRAIL協(xié)同五味子乙素對腦腫瘤干細(xì)胞生長的影響

王東東， 張 宇， 張玉影， 趙貴芳， 呂 鵬， 鐘 越， 于洪泉， 齊 玲

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，惡性程度極高。調(diào)查研究顯示：中國原發(fā)性腦腫瘤的發(fā)病率為22.52/10萬。其中，膠質(zhì)瘤占29.78%。并且，隨著惡性腫瘤發(fā)病率的逐年攀升，惡性膠質(zhì)瘤發(fā)病率的上升也最為明顯[1，2]。因此，如何有效的控制甚至治愈膠質(zhì)瘤是亟待解決的難題。研究表明，腦腫瘤干細(xì)胞(brain tumor stem cells，BTSCs) 是腦腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)及對放化療產(chǎn)生抵抗的根源[3，4]，其缺乏有效的藥物治療。膠質(zhì)瘤細(xì)胞對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的敏感性不同，而五味子乙素(Schisandrin B，SchB)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[5，6]，但兩者對BTSCs的作用不清，因此，有必要研究TRAIL和SchB對BTSCs增殖的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Sch B(中國藥品生物制品檢定所)；DMEM/F12培養(yǎng)液、神經(jīng)培養(yǎng)基、B27添加劑和小牛血清(美國Gibco公司)；TRAIL、人堿性成纖維生長因子(bFGF)和人表皮生長因子(EGF)(英國PeproTech公司)；木瓜蛋白酶(Worthington DBA，F(xiàn)reehold，NJ)；CD133免疫磁珠(Miltenyi Biotec)，二甲基亞楓(DMSO)和四甲基偶氮唑(MTT)(美國Sigma公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取新鮮人腦腫瘤組織(病理診斷為Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤)，將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入木瓜蛋白酶置于37 ℃水浴中消化45 min，300 g，350 r/min，離心5 min，加入卵類黏蛋白液3 ml終止反應(yīng)，反復(fù)吹打過濾，300 g，350 r/min，速度離心5 min，加入紅細(xì)胞去除液，搖床振蕩10 min。離心后細(xì)胞中加入無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞(神經(jīng)培養(yǎng)基含有EGF 20 μg/L、bFGF 20 μg/L、B27添加物)，再次離心后將細(xì)胞重懸培養(yǎng)液中，臺盼藍計數(shù)活細(xì)胞，以2×106/75 cm2密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)12 h。

1.3 CD133免疫磁珠篩選BTSCs 將上述培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在次日吹打混勻后70 μm濾器過濾，計數(shù)活細(xì)胞。分選緩沖液洗滌，800 g，900 r/min速度離心3 min，將沉淀加入300 μl分選緩沖液混勻，再加入100 μl CD133免疫磁珠，混勻后4 ℃避光孵育30 min，再加入緩沖液洗滌，以800 g，900 r/min速度離心10 min，棄上清，再用緩沖液重懸細(xì)胞。先用500 μl緩沖液沖洗分選柱，將細(xì)胞懸液過柱，緩沖液洗分選柱3次，移柱出磁場，1 ml緩沖液洗柱，用泵加壓，收集洗液為CD133+細(xì)胞(即BTSCs)。

1.4 細(xì)胞增殖能力分析 機械分離BTSCs將其制成單細(xì)胞懸液，以5×103個/孔密度將其均勻接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜。次日加入TRAIL(0、1、3、10、30和100 μg/ml)；Sch B (0、12.5、25、50和100 μg/ml)；TRAIL(0、1、3、10、30和100 μg/ml)聯(lián)合Sch B(100 μg/ml)，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，藥物作用24 h時，各孔再加入MTT 20 μl，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清，每孔加入DMSO150 μl，振蕩后在全自動酶標(biāo)儀上測定各孔490 nm區(qū)的吸光度值，并依據(jù)公式計算細(xì)胞增殖能力=(A用藥組/A對照組)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 TRAIL影響B(tài)TSCs增殖 不同濃度TRAIL作用于BTSCs 24 h時，均可以抑制細(xì)胞的生長增殖，尤其30 μg/ml和100 μg/ml組細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表1)。

表1 TRAIL對BTSCs增殖能力的影響

與對照組比較：*P<0.01

2.2 Sch B影響B(tài)TSCs增殖 不同濃度Sch B作用于BTSCs 24 h時，均可以抑制細(xì)胞的生長增殖，尤其25 μg/ml、50 μg/ml和100 μg/ml組細(xì)胞的增殖能力均明顯受到抑制，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表2)。

表2 Sch B對BTSCs增殖能力的影響

與對照組比較：*P<0.01

2.3 TRAIL聯(lián)合Sch B對BTSCs增殖的影響 不同濃度TRAIL聯(lián)合100 μg/mlSch B作用于BTSCs 24 h時，均可以明顯地抑制BTSCs 的生長增殖，與空白對照組比較，TRAIL濃度為30 μg/ml和100 μg/ml可抑制其增殖可達到50%以上，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 TRAIL聯(lián)合Sch B對BTSCs增殖能力的影響

TRAIL濃度(μg/ml)細(xì)胞增殖率(%)對照組TRAIL組+SchB(100 μg/ml)組0131030100100.00±4.0887.67±7.3183.63±7.5081.75±4.6548.97±4.16?42.85±4.76?

與對照組比較*P<0.01

3 討 論

2008年美國國家綜合癌癥網(wǎng)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)統(tǒng)計近30年美國癌癥，原發(fā)性惡性腦腫瘤發(fā)病率正呈逐年遞增，年增長率約為1.2%，老年人群尤為明顯。國內(nèi)尚缺大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。惡性膠質(zhì)瘤確診后首選手術(shù)療法，術(shù)后結(jié)合放化療等綜合治療。很多學(xué)者對惡性膠質(zhì)瘤的化療及放療等進行了大量研究，進展不明顯。近年，腫瘤生物學(xué)研究表明，腦腫瘤中存在一小群特殊的BTSCs，它們決定了腦腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)以及耐藥與否[5，6]。

TRAIL凋亡傳導(dǎo)途徑是人體內(nèi)重要的、天然的抗腫瘤途徑，但大多數(shù)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞都存在TRAIL 抵抗現(xiàn)象[7，8]，甚至在初期用藥敏感后還會再出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥。因此，TRAIL耐藥問題急需解決。膠質(zhì)瘤發(fā)生耐藥是由于BTSCs的存在[3，4]。此前我們在研究中發(fā)現(xiàn)，長白山特色藥物五味子的主要成份Sch B可以抑制膠質(zhì)瘤的體內(nèi)外生長，并可以通過活化線粒體通路促進腫瘤細(xì)胞凋亡[9]。因此，TRAIL聯(lián)合Sch B可能解決TRAIL耐藥的問題。

我們原代培養(yǎng)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，應(yīng)用CD133免疫磁珠分選法獲得BTSCs。應(yīng)用MTT法檢測TRAIL、Sch B單獨及聯(lián)合作用對BTSCs增殖的影響發(fā)現(xiàn)：TRAIL和Sch B均可以濃度依賴性地抑制BTSCs的增殖作用，當(dāng)兩者聯(lián)合作用時，可發(fā)生明顯的協(xié)同作用。尤其在高濃度TRAIL與Sch B共同作用BTSCs后，可以抑制BTSCs的增殖達50%以上。以上結(jié)果說明，Sch B有可能解決TRAIL耐藥問題，但其機制需進一步深入研究。