PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號(hào)通路在大鼠腦缺血再灌注損傷中的相互作用

邱 月， 邢雪松， 呂威力

血管性癡呆(Vascluar Dementia，VD)是由腦缺血、出血或急慢性缺氧性腦血管病等腦血管疾病引起的有記憶及認(rèn)知功能障礙為表現(xiàn)的臨床綜合征，是臨床上老年期癡呆的一種常見(jiàn)類(lèi)型，其患病率僅次于阿爾茨海默病，是第二大老年期癡呆病。當(dāng)前，血管性癡呆的病因多種多樣，發(fā)病機(jī)制也尚不明確，但是圍繞著血管性癡呆的腦血管危險(xiǎn)因素的相關(guān)因素越來(lái)越多，血管性癡呆是當(dāng)前唯一可預(yù)防性的癡呆類(lèi)型，所以明確其危險(xiǎn)因素對(duì)于疾病的早期預(yù)防有重要意義。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B (phosphoinositide 3 kinase/Akt，PI3K/Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在于各種細(xì)胞中，是參與細(xì)胞存活、增殖和分化調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。GSK-3β既是PI3K/Akt信號(hào)通路下游的分子，同時(shí)它又是Wnt信號(hào)通路對(duì)β-catenin調(diào)控的關(guān)鍵因子[1～4]。GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過(guò)對(duì)磷酸化細(xì)胞內(nèi)多種蛋白，廣泛參與細(xì)胞基本調(diào)節(jié)功能，比如細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架和基因表達(dá)的穩(wěn)定等[5，6]。為了更加深入的研究Akt/GSK-3β在腦缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制中的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)采用bFGF和LY294002體內(nèi)注射，觀察激活和抑制PI3K/Akt通路對(duì)其下游分子的影響，并通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSK-3β的含量，探討Akt對(duì)GSK-3β的調(diào)控作用，目的在于進(jìn)一步闡述PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號(hào)通路在缺血性腦損傷中的協(xié)同作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 化學(xué)試劑 LY294002，兔抗大鼠p-Akt多克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)，HRP-標(biāo)記的羊抗兔抗體IgG(北京中杉公司)，原位末端標(biāo)記細(xì)胞凋亡TUNEL試劑盒(天津?yàn)蠊荆琑oche分裝)。LY294002溶于DMSO，用生理鹽水將DMSO濃度稀釋為總體積的0.02%。其它未提到的試劑購(gòu)買(mǎi)于Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 級(jí)健康雄性SD大鼠78只，10～12 w齡，體重在280～320 g。購(gòu)于沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)(SCXK(遼)2003-0016)。建立局灶性腦缺血再灌注SD大鼠模型，將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(S組)、腦缺血再灌注組(I/R組)、腦缺血再灌注+bFGF后處理組(bFGF組)、腦缺血再灌注+bFGF后處理+LY294002(LY組)，每組各24只大鼠。依據(jù)缺血后再灌注時(shí)間點(diǎn)12 h、24 h、48 h、72 h，將每組大鼠再分成4個(gè)亞組。

1.3 動(dòng)物模型 依照Longa改良法建立局灶腦缺血再灌注SD大鼠模型。腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg進(jìn)行麻醉，取仰臥位，頸正中切口約3 cm，逐層分離頸前組織，依次暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，并結(jié)扎右側(cè)頸總、頸外動(dòng)脈，用酒精燈將4-0尼龍線燒成圓頭，在頸總動(dòng)脈分叉處上方約2 mm處將其插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直至感覺(jué)有輕微阻力處為大腦中動(dòng)脈入口，線拴進(jìn)入深度約為18～20 mm。假手術(shù)組線栓進(jìn)入約為10 mm。阻塞2 h后，抽出尼龍線開(kāi)始再灌注。術(shù)后大鼠出現(xiàn)左側(cè)以前肢為重的偏癱提示造模成功。缺血后30 min給予bFGF處理，從右側(cè)側(cè)腦室注射含bFGF1.2 μg生理鹽水10 μl。S組和I/R組于相同時(shí)間點(diǎn)向右側(cè)側(cè)腦室注射等體積的生理鹽水；LY組于再灌注前15 min按照0.3 mg/kg將LY294002經(jīng)股靜脈注入大鼠體內(nèi)。各組大鼠分別于再灌注12 h、24 h、48 h、72 h再次麻醉，用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，固定后取腦，制備石蠟切片厚約4 μm，進(jìn)行HE染色觀察大腦皮質(zhì)組織學(xué)形態(tài)。

1.4 TUNEL原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡 石蠟切片二甲苯脫蠟，酒精梯度水化，以3%過(guò)氧化氫30 ℃避光處理10 min，微波抗原修復(fù)3 min，加TUNEL反應(yīng)液，37 ℃孵育1 h，加轉(zhuǎn)化劑-PO，37 ℃孵育30 min，DAB顯色約3 min。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟水化，3%過(guò)氧化氫室溫避光孵育10 min，抗原修復(fù)(微波修復(fù))3 min，正常山羊血清封閉，室溫下孵育20 min，滴加一抗(p-Akt，稀釋1∶200)4℃孵育過(guò)夜。生物素化二抗工作液處理，37 ℃孵育30 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，DAB顯色約3 min。蘇木素復(fù)染，分化返藍(lán)，中性樹(shù)膠封片。

1.6 原位雜交法測(cè)定GSK-3β mRNA的表達(dá) 采用多相寡核苷酸探針，地高辛標(biāo)記。針對(duì)大鼠GSK-3β寡核苷酸探針序列：5’-CTCCT CGGAC CAGCT GCTTT GCACT TCCAA-3’。切片經(jīng)新鮮配制的0.5%H2O2/甲醇室溫處理30 min，3%枸櫞酸新鮮稀釋的胃蛋白酶37 ℃消化。切片于37℃恒溫箱預(yù)雜交2 h后，滴加雜交液40℃過(guò)夜，滴加封閉液、生物素化鼠抗地高辛、鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物和生物素化過(guò)氧化物酶。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色評(píng)估組織學(xué)改變 S組神經(jīng)元數(shù)量較多，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；I/R組和LY組神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，核分布不均，細(xì)胞周?chē)g隙增寬，有的細(xì)胞體積縮小，核固縮深染，以缺血再灌注48 h組腦皮質(zhì)變化最為明顯；bFGF組右側(cè)大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)比I/R組和LY組增多，神經(jīng)元胞體腫脹明顯減輕，細(xì)胞形態(tài)明顯改善(見(jiàn)圖1)。

2.2 TUNEL檢測(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡 TUNEL陽(yáng)性染色結(jié)果為細(xì)胞核呈棕黃色顆粒，I/R組和LY組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡趨勢(shì)相似，隨著再灌注時(shí)間的增長(zhǎng)凋亡細(xì)胞逐漸增多，在48 h達(dá)到高峰，72 h逐漸減少。而在同一時(shí)間點(diǎn)I/R組和LY組凋亡細(xì)胞數(shù)較S組明顯增加(P<0.05)，相較于I/R組和LY組bFGF組皮質(zhì)凋亡細(xì)胞明顯減少(P<0.05)(見(jiàn)圖1、表1)。

2.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大腦皮質(zhì)p-Akt的表達(dá) S組大鼠大腦皮質(zhì)p-Akt陽(yáng)性表達(dá)較少，I/R組和LY組較S組表達(dá)明顯增多(P<0.05)。I/R組和LY組右側(cè)大腦皮質(zhì)p-Akt陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物在腦血缺再灌注后24 h達(dá)到高峰，然后逐漸減少。bFGF組、I/R組和LY組p-Akt陽(yáng)性表達(dá)趨勢(shì)均相同，但是bFGF組p-Akt陽(yáng)性表達(dá)明顯增加(P<0.05)(見(jiàn)圖1、表2)。

2.4 原位雜交檢測(cè)GSK-3βmRNA的表達(dá) 右側(cè)大腦皮質(zhì)GSK-3βmRNA表達(dá)在I/R組和LY組陽(yáng)性表達(dá)較S組表達(dá)明顯增多(P<0.05)，GSK-3βmRNA陽(yáng)性產(chǎn)物出現(xiàn)在大鼠腦缺血再灌注后12 h，在48 h陽(yáng)性表達(dá)達(dá)高峰，然后72 h逐漸減少。bFGF組與I/R組和LY組比較，GSK-3βmRNA在右側(cè)大腦皮質(zhì)胞漿內(nèi)表達(dá)明顯減低(P<0.05)(見(jiàn)圖1、表3)。

表1 各組腦缺血再灌注大腦皮質(zhì)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

vs Sham group；*P<0.05，vs I/R and LY group△P<0.05

表2 大鼠腦缺血后大腦皮質(zhì)神經(jīng)元p-Akt表達(dá)的吸光度值

*P<0.05 vs Sham group；△P<0.05 vs I/R and LY group

表3 大鼠腦缺血后大腦皮質(zhì)神經(jīng)元GSK-3βmRNA表達(dá)的吸光度值

*P<0.05 vs Sham group；△P<0.05 vs I/R and LY group

A：HE染色檢測(cè)各組缺血再灌注48 h大鼠大腦皮質(zhì)組織學(xué)改變；B：TUNEL法檢測(cè)各組缺血再灌注48 h大鼠大腦皮質(zhì)凋亡細(xì)胞數(shù)；C：免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組缺血再灌注24 h大鼠大腦皮質(zhì)p-Akt的表達(dá)；D：免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組缺血再灌注48 h大鼠大腦皮質(zhì)p-Akt的表達(dá)；E：原位雜交法檢測(cè)各組缺血再灌注24 h大鼠大腦皮質(zhì)GSK-3βmRNA的表達(dá)；F：原位雜交法檢測(cè)各組缺血再灌注48 h大鼠大腦皮質(zhì)GSK-3βmRNA的表達(dá)

圖1 腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)HE染色、TUNEL、免疫組化和原位雜交檢測(cè)(×400)

3 討 論

Akt是PI3K信號(hào)通路中一個(gè)重要的下游靶點(diǎn)，具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，Akt被激活后，可通過(guò)磷酸化胞內(nèi)多種底物蛋白質(zhì)從而調(diào)節(jié)它們的活性。PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)途徑，在促進(jìn)細(xì)胞存活及增殖、抗凋亡、調(diào)節(jié)糖代謝和蛋白合成等過(guò)程中起關(guān)鍵的作用[7～9]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用PI3K/Akt信號(hào)通路特異性抑制劑，LY294002可高度選擇性抑制PI3K，當(dāng)PI3K/Akt信號(hào)通路被抑制后，觀察其對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路主要成員GSK-3β表達(dá)的影響。通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大腦皮質(zhì)中P-Akt蛋白水平，結(jié)果提示S組大腦皮質(zhì)P-Akt表達(dá)水平在不同灌注時(shí)間點(diǎn)均低于I/R組和LY組；bFGF組各亞組P-Akt表達(dá)均高于I/R組和LY組各亞組表達(dá)，bFGF組、I/R組和LY組均在24 h達(dá)高峰，說(shuō)明bFGF可激活腦缺血再灌注損傷大鼠的PI3K/Akt信號(hào)通路，而bFGF對(duì)該通路的激活作用可被LY294002有效的抑制。此外，本實(shí)驗(yàn)還采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)Wnt信號(hào)通路主要成員GSK-3β mRNA在缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)的表達(dá)情況。結(jié)果表明I/R組和LY組缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)GSK-3β mRNA表達(dá)在不同時(shí)間點(diǎn)亞組均高于S組，分別在48 h和72 h達(dá)高峰。bFGF組各亞組GSK-3β mRNA表達(dá)明顯相較I/R組和LY組明顯降低。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可說(shuō)明bFGF可以通過(guò)激活缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)的Akt表達(dá)，進(jìn)而抑制GSK-3β的表達(dá)。在Akt/GSK-3β信號(hào)通路中，由于GSK-3β的表達(dá)減少，β-catenin被GSK-3beta-Axin-APC復(fù)合物降解減少，致使β-catenin細(xì)胞漿內(nèi)積聚，繼而進(jìn)入胞核，促進(jìn)Wnt靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，修復(fù)缺血神經(jīng)組織[10～12]。通過(guò)對(duì)缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)凋亡神經(jīng)元的檢測(cè)，bFGF組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯低于I/R組和LY組，可提示bFGF通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路保護(hù)神經(jīng)元。結(jié)合既往研究結(jié)果[13]，bFGF可抑制缺血再灌注損傷神經(jīng)元凋亡，同時(shí)可以促進(jìn)β-Catenin在腦缺血再灌注大鼠腦組織中的表達(dá)，對(duì)缺血損傷的神經(jīng)元有保護(hù)作用。綜和上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出，在腦缺血再灌注損傷PI3K/Akt信號(hào)通路協(xié)同Wnt/β-catenin共同發(fā)揮保護(hù)修復(fù)作用，以上2條信號(hào)通路均可被bFGF激活，即bFGF- Akt-GSK-3β-β-catenin。表明PI3K/Akt和Wnt/β-catenin通路的共同成員Akt、GSK-3β和β-catenin有可能成為缺血性腦損傷治療中重要的靶分子。